背景牙周疾病是主要为菌斑所引起,进行性破坏牙周软硬组织的慢性疾病。牙周疾病的发展,会最终导致牙齿松动、脱落的严重后果,不仅影响患者的美观,还会影响其咀嚼、语言等功能,生活质量大大下降,心理健康也会受到影响。目前为止,对于牙周病的主要治疗方法包括洁治术、牙周手术等,主要目的为减缓或终止病变进展,但难以实现牙周组织的再生。近年的科学研究表明,组织工程技术是牙周组织再生的一种很有前景的治疗方法。组织工程牙周再生可以应用的种子细胞有牙周膜干细胞、骨髓间充质干细胞、脂肪干细胞等多种干细胞。但实验证明不同种类干细胞的各项分化潜能具有差异性,且具有向来源组织分化的倾向性,因此我们认为牙周膜干细胞可能是用于牙周再生最好的选择。除了种子细胞,生物支架材料也是组织工程中必不可少的组成部分。支架可以为种子细胞提供适宜的生长环境,引导细胞的生长发育,支架材料要具有良好的生物相容性、合适的机械性能,并能加载一些有利于细胞增殖分化的细胞因子,最好是支架材料本身就富含相关因子。牙本质基质来源广泛,生物相容性较好,而且其中富含各种生长因子和细胞因子,是一种很好的支架材料,且其可以模拟临床上患者口内牙本质暴露的环境。釉基质衍生物来源于发育中的牙齿组织,富含各种与牙齿发育相关的蛋白质,可以促进牙周损伤恢复和牙周组织再生。本课题首次将釉基质衍生物加载于牙本质基质支架上,以对其进行改性,并研究釉基质衍生物改性后的牙本质支架对人牙周膜干细胞的生物学影响,主要包括细胞的增殖、黏附、成骨成牙骨质向分化,同时也对相关的机制进行了初步探索。方法1.人牙周膜干细胞的分离培养及鉴定分离培养人牙周膜干细胞,采用CCK-8法测定增长曲线,测定克隆形成率,流式细胞技术检测细胞表面标志物,对细胞进行ALP、茜素红、油红O染色以检测成骨成脂能力。2.釉基质衍生物改性的牙本质支架的制备制备牙本质支架,将釉基质衍生物以不同浓度加载于支架上,扫面电镜下观察其形貌。3.釉基质衍生物改性的牙本质支架对人牙周膜干细胞的生物学影响CCK-8法测定不同浓度釉基质衍生物改性的牙本质支架上培养的人牙周膜干细胞的增长曲线,DAPI和鬼笔环肽染色检测细胞黏附伸展情况。4.釉基质衍生物改性的牙本质支架对人牙周膜干细胞成脂成骨分化的影响及相关机制初步探索实时荧光定量PCR检测复合支架上人牙周膜干细胞成骨成牙骨质基因的表达,并做对比分析;wester-blot法检测成牙骨质相关蛋白的表达水平并对比分析;用抑制因子DKK1阻断wnt通路,qPCR法检测wnt通路相关基因的相对表达并对比分析。结果1.培养的人牙周膜干细胞检测出间充质干细胞表面标志分子,ALP、茜素红染色可见矿化结节,油红O染色见细胞内脂滴形成。2.制备的牙本质支架表面光滑,牙本质小管充分暴露;釉基质衍生物铺在牙本质支架表面,成不同大小的球状,有的进入牙本质小管内。3.改性牙本质支架上培养的人牙周膜干细胞与对照组相比,在相同时间点增殖更快、黏附速度更快、伸展程度更大。4.与对照组相比,改性牙本质支架组细胞的成骨及成牙骨质基因表达相对升高,成牙骨质相关蛋白表达相对升高;与对照组和加入DKK1抑制剂组相比,改性牙本质支架组细胞wnt通路相关基因表达也要相对较高。结论1.培养出的人牙周膜干细胞具有多向分化潜能,符合间充质干细胞的鉴定。2.成功制备釉基质衍生物改性的牙本质支架。3.釉基质衍生物改性的牙本质支架可以促进人牙周膜干细胞的增殖、黏附、以及成骨成牙骨质向分化,且其机制可能与经典wnt通路相关。