糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一种以血浆葡萄糖升高和糖耐量降低为主要特点的糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱综合征。2型糖尿病(Type 2 Diabetes Mellitus,T2DM)占糖尿病患者的90%以上,主要由胰岛素抵抗和胰岛素分泌障碍引起。西药虽然降糖效果显著,但有着低血糖反应、肝肾毒性和药物继发性失效等缺陷,故新型高效、低毒抗糖尿病药物的研发仍然是世界各国面临的科学难题。中医药治疗糖尿病则有着疗效确切且副作用小的优点。LM颗粒(LM Granules,LMG)是伍炳彩教授创立的中药复方,临床观察显示其在治疗T2DM上有显著疗效,是从肝论治糖尿病的经验方。为了使LMG在临床上得到更广泛的应用,实验验证其降糖疗效并探索其作用机制,从而为该方提供科学的数据支持,势在必行。目的:制备2型糖尿病GK大鼠模型,观察中药复方制剂LMG对GK大鼠的一般症状、葡萄糖代谢、胰岛功能、胰腺组织病理变化、炎症因子、氧化应激及JNK信号通路的影响;探讨LMG降低血糖的作用及其相关机制,从而为LMG治疗T2DM的临床应用提供实验室依据。方法:1.动物造模:连续给予GK大鼠饲喂高脂饮食2周以制备T2DM大鼠模型,以空腹血糖≥11.1 mmol/L的大鼠为造模成功的大鼠。2.分组与给药:取SD大鼠8只,设为正常对照组(正常组)。将造模成功的GK大鼠随机分为6组,每组8只:模型对照组(模型组),LMG低、中、高剂量组(LMG低、LMG中、LMG高),参芪降糖颗粒组(参芪组)和格列齐特片组(格列组)。分组后灌胃给予相应药物;每日一次,连续9周;正常组和模型组则等量纯净水灌胃。3.样本采集与指标测定:给药期间,每天观察大鼠一般症状,每周记录大鼠体重,并且每3周检测大鼠空腹血糖(FBG)。末次给药后,大鼠禁食12 h再进行口服葡萄糖耐量试验(OGTT)并计算曲线下面积(AUC)。然后,麻醉大鼠腹主动脉采血。最后,解剖大鼠迅速取出胰腺组织。取血清,用酶联免疫法(ELISA)检测糖化血红蛋白(HbA1c)和胰岛素(INS)水平并计算胰岛素抵抗指数(IRI)和胰岛素敏感性指数(ISI);ELISA检测炎症因子TNF-α和IL-1β含量。生物化学法检测血清超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量。HE染色和醛复红染色分别观察大鼠胰岛病理组织学变化和胰岛β细胞比例;蛋白印迹法(WB)检测胰腺JNK、p-JNK(Thr183/Tyr185)、Akt、p-Akt(Ser473)蛋白表达水平。4.统计学分析:采用SPSS 17.0软件对数据进行分析,所有数据用均数土标准差(x± s)表示;多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA),以P<0.05为差异有统计学意义。成果:1.一般症状.:与正常组比较,模型组大鼠体形较瘦,反应迟钝、嗜睡,毛色粗糙、较脏,体重自给药第2周起下降,且差异显著(P<0.01);各给药组大鼠状态较模型组有一定的改善,但体重变化无明显差异(P>0.05)。2.葡萄糖代谢:给药9周后,模型组大鼠的FBG水平较正常组升高,差异显著(P<0.01);与模型组比较,各给药组大鼠的FBG水平下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与给药前比较,除LMG低剂量组外,其余各给药组大鼠的FBG水平下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);与参芪组和格列组比较,LMG中、高剂量组大鼠的FBG水平与之差异无统计学意义(P>0.05)。给药9周后,模型组大鼠的HbA1c含量较正常组升高,差异显著(P<0.01);除LMG中剂量组外,其余各给药组大鼠的HbA1c含量较模型组下降,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01);LMG各剂量组大鼠的HbA1c含量与参芪组和格列组差异无统计学意义(P>0.05)。3.胰岛功能:与正常组比较,模型组大鼠的AUC、IRI值上升,INS、ISI值下降,差异显著(P<0.01)。与模型组比较,各给药组大鼠的AUC值均下降(P<0.05或0.01);各给药组大鼠血清INS含量升高但差异无统计学意义(P>0.05),但LMG高剂量组和格列组与模型组的INS均值差大于2 μ IU/mL。另外,LMG高剂量组、参芪组和格列组大鼠的IRI值较模型组下降,ISI值较模型组上升,差异有统计学意义(P<0.05 或P<0.01)。4.胰腺组织病理:与正常组比较,模型组大鼠胰岛组织形态不规则并边缘不整齐、胰岛体积缩小、β细胞比例较显著减少并分布不均,部分胰岛出现细胞核聚集现象;与模型组比较,给药各组大鼠胰岛形态有所好转,其中LMG高剂量组、参芪组以及格列组大鼠胰岛未出现细胞核聚集现象,但胰岛β细胞比例仍较正常组显著下降。5.炎症细胞因子:与正常组比较,模型组大鼠血清TNF-α和IL-1β含量升高,差异显著(P<0.01)。与模型组比较,不同剂量的LMG均可降低大鼠TNF-α和IL-1β水平,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01),参芪降糖颗粒和格列齐特片亦能显著降低大鼠TNF-α和IL-1β含量(P<0.01)。6.氧化应激水平:与正常组比较,模型组大鼠的血清SOD活性明显降低,MDA含量明显升高,差异显著(P<0.01);与模型组比较,LMG低、中、高剂量均能明显增加大鼠SOD活性,LMG中、高剂量还能明显降低大鼠血清MDA水平,差异显著(P<0.01);参芪降糖颗粒和格列齐特片均能显著升高SOD活性,降低MDA含量(P<0.01)。7.JNK信号通路:与正常组比较,模型组p-JNK/JNK值明显升高,p-Akt/Akt值明显降低,差异显著(P<0.01),说明JNK蛋白磷酸化水平升高,Akt蛋白磷酸化水平降低。与模型组比较,给药各组大鼠的p-JNK/JNK值均明显降低(P<0.01);LMG中、高剂量组,参芪组和格列组p-Akt/Akt值均明显升高,差异有统计学意义(P<0.01),说明LMG、参芪降糖颗粒和格列齐特片均能抑制JNK蛋白磷酸化而促进Akt蛋白磷酸化。结论:1.LMG能降低T2DM模型GK大鼠的空腹血糖和糖化血红蛋白水平,表明其具有调节葡萄糖代谢、维持葡萄糖稳态的作用。2.LMG可提高T2DM模型GK大鼠的葡萄糖耐量、减轻胰岛素抵抗并增加胰岛素敏感性,提示其对糖尿病大鼠的胰岛功能具有一定的保护作用,这可能是其发挥降血糖功效的原因。3.LMG可改善T2DM模型GK大鼠胰岛组织的形态和结构,提示其可减轻胰岛的病理损伤,这可能是其胰岛功能得到改善的原因。4.LMG可减少T2DM模型GK大鼠体内炎症因子TNF-α和IL-Iβ的含量,提示其具有一定的抗炎功效,这可能是其减轻胰岛素抵抗、保护胰岛结构和功能的原因之一。5.LMG可提高T2DM模型GK大鼠体内抗氧化酶SOD活性,并降低过氧化产物MDA含量,说明其具有抑制氧化应激的能力,这可能是其减轻胰岛素抵抗、保护胰岛结构和功能的原因之一。6.LMG可抑制T2DM模型GK大鼠胰腺组织中JNK蛋白的磷酸化而促进Akt蛋白的磷酸化,初步阐明了其保护胰岛结构和功能的原因。综上所述,我们的结果表明中药复方制剂LMG能降低T2DM模型GK大鼠的空腹血糖及糖化血红蛋白水平,改善糖耐量及胰岛素抵抗,对胰岛组织的结构和功能具有一定的保护作用。其潜在的作用机制可能与改善糖尿病大鼠体内的炎症状态,提高抗氧化应激能力以及抑制JNK信号通路等有关。