【摘 要】
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猪骨骼肌生长发育的机制一直备受关注,骨骼肌作为猪体重占比最高的组织,其生长发育直接影响了猪的生产性能。骨骼肌的生长发育是一个相对复杂的生物学过程,其中包括肌细胞的形成与增殖、肌管和肌纤维的形成以及终末成熟阶段。随着生命科学的发展,学术界对骨骼肌发育调控机制以及其中相关基因的调控作用有了深入的认识,但在猪骨骼肌生长发育调控机制研究中,仍然有许多与其发育过程相关的基因尚未被发掘。有研究报道,ITGB6
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猪骨骼肌生长发育的机制一直备受关注,骨骼肌作为猪体重占比最高的组织,其生长发育直接影响了猪的生产性能。骨骼肌的生长发育是一个相对复杂的生物学过程,其中包括肌细胞的形成与增殖、肌管和肌纤维的形成以及终末成熟阶段。随着生命科学的发展,学术界对骨骼肌发育调控机制以及其中相关基因的调控作用有了深入的认识,但在猪骨骼肌生长发育调控机制研究中,仍然有许多与其发育过程相关的基因尚未被发掘。有研究报道,ITGB6基因在猪骨骼肌发育过程中差异性表达,并且在表观遗传的修饰作用下调节着骨骼肌的发育。因此,为了深入研究ITGB6基因对猪骨骼肌发育的调控作用,我们首先从一日龄仔猪中分离出了猪骨骼肌卫星细胞作为研究猪骨骼肌发育机制的模型;随后构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-ITGB6,以及合成了ITGB6基因的干涉片段,转染猪骨骼肌卫星细胞,通过CCK-8法、EdU染色、Western Blot和流式细胞术等技术研究了ITGB6基因对猪骨骼肌卫星细胞增殖的调控作用。主要研究结果如下:(1)利用组织块消化法从一日龄仔猪的肌肉组织中分离出了原代猪骨骼肌卫星细胞并用差速贴壁法进行纯化。结果表明,分离出的猪骨骼肌卫星细胞增殖速度快,呈现出较强的肌源性特征,并且分化后显微镜下可观察到大量的肌管形成。(2)运用流式细胞术鉴定猪骨骼肌卫星细胞的纯度。结果显示,纯化后的猪骨骼肌卫星细胞中PAX7呈阳性的细胞到达98.5%,说明卫星细胞纯度较高,可用于后续实验。(3)对猪骨骼肌卫星细胞转染pcDNA3.1-EGFP鉴定其转染效率。转染后的GFP阳性细胞统计结果表明,猪骨骼肌卫星细胞的转染效率为41.2%。(4)使用CCK-8法和EdU染色法分析上调/下调ITGB6基因的表达对猪骨骼肌卫星细胞增殖的影响。结果发现,上调ITGB6基因的表达抑制了猪骨骼肌卫星细胞的增殖活性,下调ITGB6基因的表达促进了猪骨骼肌卫星细胞的增殖活性。(5)使用Western Blot技术在蛋白水平分析上调/下调ITGB6基因的表达对猪骨骼肌卫星细胞中细胞增殖标记蛋白Ki67表达量的影响。结果表明,上调ITGB6基因的表达抑制了猪骨骼肌卫星细胞中Ki67的表达,下调ITGB6基因的表达促进了猪骨骼肌卫星细胞中Ki67的表达。(6)使用流式细胞术分析上调/下调ITGB6基因的表达对猪骨骼肌卫星细胞周期的影响。结果表明,上调ITGB6基因的表达会降低猪骨骼肌卫星细胞中S期细胞的比率,下调ITGB6基因的表达会提高猪骨骼肌卫星细胞中S期细胞的比率。综上所述,ITGB6基因通过抑制细胞合成从而抑制骨骼肌细胞增殖,最终抑制骨骼肌的发育。
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