论文部分内容阅读
第一部分长链非编码RNA Neat1对TBI小鼠的神经保护作用及其机制研究目的:通过控制性皮层损伤（Controlled cortical injury,CCI）建立小鼠创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）模型,检测Neat1的表达变化对CCI小鼠运动及学习记忆能力和细胞凋亡的影响;探讨Neat1在TBI小鼠神经元细胞凋亡通路中的相关分子机制。方法:选取60只健康的C57BL/6J雄性小鼠（周龄:10-12;体重（g）:18-20）为本实验的研究对象。将所选小鼠以数字随机的方式分为四组:正常（假手术）组、对照组、Neat1过表达组、Nea1下调组,每组15只小鼠。经侧脑室分别注射相应的Neat1过表达或干扰（下调）腺病毒,对照组注入等量的等渗盐水。转染一周后,进行CCI建模,以模拟小鼠中度TBI。建模成功后进行后续实验:实验一:评估Neat1的变化对CCI小鼠运动、学习及记忆等神经功能的影响神经功能损伤程度评分（Neuralal Severity Score,NSS）、抓线实验和莫里斯（Morris）水迷宫分别用来评估小鼠的神经功能损伤、运动及学习、记忆功能。实验二:Western-Blot实验检测CCI小鼠PIDD1、caspase-2及活化的caspase-3在不同时间点的表达变化分别在小鼠CCI后6小时、D1（Day 1）、D3及D7四个时间点,收取伤灶周围皮层脑组织蛋白进行Western-Blot实验,分析PIDD1、caspase-2、活化的caspase-3在不同时间点的表达变化,选取变化最显著的时间点作为后续实验的取样时间。实验三:免疫荧光半定量实验测定Neat1的变化对CCI小鼠PIDD1的影响根据实验二确定的时间点,采用免疫荧光半定量实验检测Neat1过表达组、Neat1下调组、正常组小鼠皮层周围皮层脑组织中PIDD1的表达与对照组之间的差异。实验四:Western-Blot实验检测Neat1的变化对CCI小鼠PIDD1、caspase-2、细胞色素C和活化的caspase-3表达的影响根据实验二确定的时间点,进行Western-Blot实验检测Neat1过表达组、Neat1下调组、正常组与对照组小鼠伤灶周围皮层脑组织中PIDD1、caspase-2、胞浆细胞色素C及和活化的caspase-3的蛋白表达差异;根据实验二确定的时间点,进行Western-Blot实验检测Neat1过表达组、Neat1下调组、正常组与对照组小鼠伤灶周围皮层脑组织中线粒体内细胞色素C的蛋白表达差异。结果:实验一:相较对照组实验对象,Neat1过表达组的小鼠NSS评分明显降低,Neat1下调组小鼠的得分则明显增高,差异显著,提示Neat1对于改善小鼠的神经功能有益;抓线实验系统评分的结果显示,Neat1过表达组的小鼠的得分较对照组明显更高,而Neat1下调组的得分则明显降低,差异明显,提示Neat1有助于改善小鼠的抓线能力;在CCI后第15-19天的莫里斯水迷宫实验中,Neat1过表达组的小鼠找到水下平台的时间较对照组显著缩短,而Neat1下调组小鼠耗时则显著延长,提示Neat1对小鼠的记忆及学习能力有保护作用。实验二:Western-Blot实验结果显示,PIDD1与caspase-2在CCI建模后第1天表达开始显著升高,在之后的第3天和第7天均维持在较高的水平,而活化的caspase-3在建模后第3天表达量开始明显升高,故选取建模后第3天为后续实验的取样时间点。实验三:免疫荧光半定量实验结果表明,与对照组相比,Neat1过表达组的小鼠伤灶周围皮层脑组织中的PIDD1表达较对照组明显降低（p<0.05）,而Neat1下调组的小鼠的PIDD1的表达则明显增加（p<0.05）。实验四:Western-Blot实验的结果显示,Neat1过表达组小鼠伤灶周围皮层脑组织中的PIDD1、caspase-2、胞浆内细胞色素C以及活化的caspase-3较对照组有明显的下降（p<0.001）;而线粒体内细胞色素C的表达则较对照组显著升高（p<0.05）;在Neat1下调组的小鼠有相反的结果（p<0.05）。结论:Neat1可能通过抑制PIDD1和capsase-2的表达及线粒体凋亡通路的激活,影响神经元凋亡而改变创伤性脑损伤小鼠的预后。这与课题组前期的有关Neat1可能通过与PIDD1结合而抑制了细胞凋亡通路的研究结果是一致的。第二部分长链非编码RNA Neat1对体外培养皮层神经元氧糖剥夺后的凋亡抑制作用及其机制研究目的:通过体外培养原代神经元、进行氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD）模型模拟小鼠创伤性脑损伤,探讨Neat1对神经元凋亡的影响及其在线粒体凋亡通路中的相关作用机制。方法:体外培养小鼠皮层原代神经元,进行氧糖剥夺以模拟TBI。构建Neat1过表达和干扰（下调）腺病毒并分别感染神经元。建立4个实验组,即正常组、对照组、Neat1过表达组和Neat1下调组。分别进行下述实验:实验一:建立氧糖剥夺模型,并比较不同的建模时间对神经元Neat1基因表达水平的改变:神经元种板后24小时内,进行腺病毒的转染。转染成功后,分别进行2小时、3小时、4小时、5小时及6小时的氧糖剥夺,建模成功后分别提取正常组及对照组各个时间点的神经元的总RNA,进行RT-PCR,发现OGD后3小时Neat1的表达增加最显著,故选取OGD3小时作为后续实验的造模时间。实验二:氧糖剥夺后,Neat1对神经元细胞活力的影响氧糖剥夺模型建立后,用CCK-8试剂盒测定各组各孔（每个组设置6个孔）神经元细胞活力的改变,酶标仪测定各孔神经元的OD值,波长540nm,并取其平均值进行对比。实验三:Neat1的变化对OGD后神经元凋亡率的影响氧糖剥夺模型建立后,以TUNEL法检测各组神经元的细胞凋亡率的变化。实验四:Neat1的变化对OGD后神经元凋亡相关蛋白表达的影响:在氧糖剥夺模型建立后,提取各组神经元的总蛋白,用Western-Blot法测定神经元凋亡相关蛋白PIDD1、caspase-2、胞浆细胞色素C和活化的caspase-3表达水平的差异;提取线粒体蛋白,Western-Blot测定各组神经元线粒体内细胞色素C的蛋白表达差异。结果:实验一:测定对照组神经元经历不同的氧糖剥夺时间后,Neat1的基因表达变化:本实验分别提取对照组和正常组神经元总RNA,并进行RT-PCR,发现对照组在氧糖剥夺2小时和3小时后Neat1的表达明显高于正常组,而3小时时的Neat1表达更高,故选取3小时作为后续实验的造模时间。实验二:神经元细胞活力的测定四组中Neat1下调组神经元细胞的光密度值（Optical Density,OD）最低,说明Neat1下调组神经元的活力最低。Neat1过表达组的OD值明显高于对照组（p<0.05）,但低于正常组,Neat1下调组神经元的活力明显低于对照组（p<0.05）,但与正常组相比有升高。实验三:Neat1的变化对OGD后神经元细胞凋亡率的影响测定对照组TUNEL染色阳性率较正常组明显增高（p<0.05）,Neat1过表达组TUNEL染色阳性率明显低于对照组（p<0.05）,而Neat1下调组的TUNEL染色阳性率较对照组明显增高（p<0.05）。实验四:Neat1的变化对OGD后神经元凋亡相关蛋白表达的影响:Western-Blot实验结果表明,Neat1过表达组中,PIDD1、caspase-2、cleaved caspase-3的表达水平明显低于对照组（P<0.05）;Neat1下调组的PIDD1、caspase-2、cleaved caspase-3表达水平明显高于对照组（P<0.05）。此外,对照组的胞浆细胞色素C较正常组明显增高（P<0.05）,而其线粒体内细胞色素C的表达则较正常组明显降低（P<0.05）;Neat1过表达组的胞浆细胞色素C较对照组有所下降（P<0.05）,其线粒体内细胞色素C的表达较对照组明显增高（P<0.05）;Neat1下调组的胞浆细胞色素C水平明显高于对照组（P<0.05）,其线粒体内细胞色素C的表达较对照组明显降低（P<0.05）。结论:Neat1可能通过影响PIDD1-caspase-2-细胞色素C通路而抑制氧糖剥夺后神经元的凋亡,这与动物实验的研究结果一致。