卵巢恶性肿瘤占女性全身肿瘤死因顺位的第五位，在妇科肿瘤中占首位。人类卵巢上皮性癌占卵巢恶性肿瘤的90％，其5年生存率仅为25％-30％，因此卵巢上皮性癌(以下简称卵巢癌)是妇科肿瘤领域威胁女性生命的第一杀手。卵巢癌独特的生长和转移规律是广泛地转移至腹膜、隔膜和大网膜，最终由于盆、腹腔的广泛播散而导致患者死亡。因此卵巢癌治疗失败和死亡的主要原因是肿瘤的转移播散。探索肿瘤转移的分子机制对改善病人预后至关重要。但肿瘤转移的调节分子，如生长因子、粘附因子、化学吸引分子一直不被人们认识。2001年Muller等对乳腺癌和黑色素瘤进行了一系列趋化因子及其受体的研究，使人们认识到癌细胞的趋化性转移可能受CXCL12-CXCR4轴调节。以前研究证实趋化因子CXCL12及其受体CXCR4调节白细胞的迁移和造血干细胞的归巢。在肿瘤组织中表达最普遍为CXCR4。本课题是从临床到基础，层次递进的系列研究，包括CXCL12和CXCR4表达的临床意义、细胞体外实验和体内动物实验，旨在探讨CXCL12和CXCR4表达与临床病理特征、肿瘤恶性侵袭行为和预后的关系，以及CXCL12-CXCR4轴对肿瘤转移过程中多个重要步骤的影响和CXCR4拮抗剂AMD3100对体内肿瘤生长的抑制作用，从而加深对卵巢癌生物学行为的理解，为CXCR4抑制剂用于卵巢癌的治疗提供理论依据。 方法：课题分为三部分： 1趋化因子CXCL12及受体CXCR4在卵巢上皮性癌组织中的表达及其临床意义。采用免疫组化SP法检测6例正常卵巢表面上皮、17例良性上皮性卵巢肿瘤、10例交界性上皮性卵巢肿瘤、44例卵巢上皮性癌原发灶和30例相应大网膜转移灶组织中的CXCL12和CXCR4蛋白表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测12例上述卵巢上皮性癌原发灶组织的CXCL12和CXCR4mRNA表达，以及5例正常腹膜和12例卵巢癌腹膜的CXCL12mRNA表达。分析卵巢上皮性癌组织中CXCL12和CXCR4蛋白表达与患者年龄、肿瘤病理类型、手术病理分期、病理分化、术后残余灶大小、淋巴结转移、腹水、CA125下降等临床病理特征和预后关系。 2CXCL12-CXCR4轴对卵巢癌细胞增殖、迁移、侵袭和分泌的体外实验研究。人卵巢腺癌细胞株CAOV-3、3AO和SKOV3细胞体外培养。采用免疫细胞化学染色法检测3种细胞CXCR4蛋白表达，采用RT-PCR技术检测3种细胞CXCL12和CXCR4mRNA表达。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，判断在无血清培养液的生长条件下，不同浓度的CXCL12对CAOV-3和3AO细胞增殖的影响，以及CXCR4中和抗体或拮抗剂AMD3100的抑制作用。以Transwell侵袭小室为模型，应用Matrigel探讨不同浓度的CXCL12和腹水对CAOV-3和3AO细胞迁移、侵袭的影响，以及CXCR4中和抗体或拮抗剂AMD3100对此的抑制作用。采用RT-PCR技术判断CAOV-3和3AO细胞整合素β1和VEGF-CmRNA表达，以及CXCL12作用后不同时间两者的变化。 3荷人卵巢癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型的建立及实验。人卵巢腺癌细胞株CAOV-3体外培养。将裸鼠分为A、B两组。1×107CAOV-3细胞接种于裸鼠左肋背部皮下，3小时后A组腹腔注入CXCR4拮抗剂AMD3100。2周左右待移植瘤长径达0.7-1cm时，将B组随机分为B1和B2两组，B1组腹腔内注入PBS，B2组腹腔注入AMD3100，观察三组移植瘤体积的变化，计算抑瘤率。 结果： 1正常卵巢表面上皮细胞无CXCL12和CXCR4蛋白表达，但两者共表达在卵巢皮质的卵泡细胞。17例卵巢良性上皮性肿瘤CXCL12和CXCR4蛋白阳性率分别为100％和88％；10例卵巢交界性上皮性肿瘤CXCL12和CXCR4蛋白阳性率均为90％，在卵巢良性和交界性上皮肿瘤中CXCL12阳性细胞为细胞质出现棕黄色颗粒，CXCR4为细胞核出现棕黄色颗粒。正常腹膜有CXCL12mRNA表达，其表达量与癌腹膜相近，显著低于癌组织(P＜0.05)。12例卵巢上皮性癌组织均有CXCL12(1.13±0.12)和CXCR4(0.9±0.1)mRNA表达，44例卵巢上皮性癌原发灶的CXCL12和CXCR4蛋白表达阳性率分别为91％和59％。CXCL12阳性细胞为细胞质着色；在26例CXCR4阳性表达肿瘤中，仅1例为细胞核着色，其余为细胞质着色。原发灶的CXCR4表达与淋巴结转移无关，但将原发灶和转移灶的CXCR4表达相结合，CXCR4表达与淋巴结转移有显著相关性(P=0.018)。CXCL12表达强度与术中腹水量呈显著相关(P=0.014)。难治复发组的CXCR4阳性率(81％)显著高于无复发组(28％，P=0.001)。单因素分析显示：CXCR4阳性表达的患者中位数肿瘤无进展生存时间和总生存时间(15个月、27个月)明显短于CXCR4阴性表达者(＞21个月、＞32个月，分别为P＜0.001和0.017)。多因素分析显示：CXCR4表达和残余灶大小是影响卵巢上皮性癌患者肿瘤无进展生存时间和总生存时间的独立预后因素。 2CAOV-3卵巢癌细胞有CXCR4mRNA和蛋白表达，无CXCL12mRNA表达。在100ng/mlCXCL12作用下，CXCR4mRNA表达显著增加(P＜0.05)。3AO细胞有极弱的CXCR4mRNA和蛋白表达。在无血清的亚最佳生长条件下，培养第1、2、3天，100ng/mlCXCL12可明显刺激CAOV-3和3AO细胞的增殖(P＜0.05)，而10ng/mlCXCL12对CAOV-3和3AO细胞的增殖与对照组比较无显著差异(P＞0.05)；100ng/mlCXCL12对细胞的增殖作用能被10ug/mlCXCR4中和抗体或1ug/mlAMD3100所抑制；在没有CXCL12的作用下，单纯的10ug/mlCXCR4中和抗体不能抑制细胞的增殖。CXCL12对CAOV-3和3AO细胞的迁移有明显的趋化性，随CXCL12浓度的增加迁移的细胞数显著增多(P＜0.05)，并被10ug/mlCXCR4中和抗体或1ug/mlAMD3100所抑制。腹水对CAOV-3细胞的迁移作用显著强于CXCL12(P＜0.05)，并不被CXCR4中和抗体和VEGF中和抗体所抑制。CXCL12对3AO细胞的迁移作用程度小于CAOV-3细胞。在无血清培养液作为对照时，CAOV-3穿过Matrigel的细胞数很少；10ng/mlCXCL12使CAOV-3穿过Matrigel的细胞数增多(P＜0.05)，100ng/mlCXCL12使CAOV-3穿过Matrigel的细胞数显著增多，其水平超过10ng/mlCXCL12(P＜0.05)，表明随CXCL12浓度增加细胞侵袭性增强，这种侵袭能被10ug/mlCXCR4中和抗体或1ug/mlAMD3100抑制。卵巢癌腹水使CAOV-3穿过Matrigel细胞明显增多，其水平超过100ng/mlCXCL12(P＜0.05)，并且不被CXCR4中和抗体和VEGF中和抗体所抑制。CXCL12不能促进3AO细胞穿过Matrigel。CAOV-3细胞有整合素β1(0.534±0.1)和VEGF-CmRNA(0.524±0.09)表达。100ng/mlCXCL12作用后3小时整合素β1mRNA表达显著增加(1.527±0.16)(P＜0.05)，24小时维持高水平。100ng/mlCXCL12作用后8小时VEGF-CmRNA表达开始增多(0.803±0.1)，24小时显著增加(1.107±0.15)(P＜0.05)。3AO细胞无VEGF-C和整合素β1mRNA表达，CXCL12作用后24小时内未能诱导VEGF-C和整合素β1mRNA表达。 3B1组(对照组)裸鼠皮下移植瘤生长速度最快。实验结束时，A组(成瘤前腹腔注入AMD3100)移植瘤体积显著小于B1和B2(成瘤后腹腔注入AMD3100)组(P＜0.01)，B1组移植瘤体积显著大于B2组(P＜0.01)。B2组抑瘤率为66.11％。B1组移植瘤表面充血，新生血管生成明显。 结论：CXCR4在卵巢上皮性癌中的表达阳性率较高，是影响其预后的独立指标之一。体外实验证实CXCL12可促进细胞的增殖、迁移、侵袭、分泌整合素β1和VEGF-C，并被CXCR4中和抗体或拮抗剂AMD3100抑制，表明CXCL12-CXCR4轴在卵巢癌的生长和转移中发挥重要作用。动物实验表明CXCR4拮抗剂AMD3100可明显抑制卵巢癌裸鼠皮下移植瘤的生长。总结实验，我们可以推断，阻止CXCL12和CXCR4相互作用可为肿瘤治疗提供广阔前景。