目的本实验在前期动物实验已确定古方天灸药物白芥子散穴位贴敷治疗哮喘最佳配比的基础上,确定应用古方天灸药物白芥子散进行穴位贴敷治疗对哮喘大鼠的气道炎症有显著地抑制作用和免疫调节作用,促使免疫功能恢复正常,即古方天灸药物白芥子散在免疫稳态重建中有重要作用。拟从基因角度对白芥子散在小儿哮喘的发病机制、免疫稳态重建机制、治疗机制等方面进行研究,提高哮喘的诊断准确性和治疗靶向性,为临床应用提供实验依据与理论支撑。方法将雄性清洁SD大鼠90只,4~6周龄,体重(150±20)g,按均衡随机法(按体重分层)分为3组,分别为给药组、模型组A组和B组(各15只)、正常组,每组实验动物30只。第1天,给药组、模型组分别于用新鲜配制的OVA,100mg辅以氢氧化铝凝胶200mg及生理盐水1ml的混悬液在大鼠两腹股沟、后足跖,共4点做皮下注射,每点0.2ml,同时腹腔注射0.2ml,正常组不做任何处理。第15天中处死模型组A组,正常组5只大鼠,收集并保存需检测部位的标本,以便于确认造模成功后动物的体内基因表达状态,模型组B组留用作为治疗对照。第15~24天给药组开始进行天灸贴敷治疗,穴位贴敷前用8%硫化钠在穴位处脱毛,将药丸放在医用脱敏胶贴上,分别贴于大鼠肺俞(双)、定喘、膻中、膏肓(双)处,每天1次,每次贴敷2~4h,贴敷治疗后,将实验组致敏的大鼠置于密闭容器内用超声雾化器雾化吸入2%OVA生理盐水悬液,每天30min,进行激发诱喘1次,连续10天。模型组B组予空白贴敷,处理方法同给药组。正常组自由进食常规饲料和水。第25天处死大鼠,采集肺组织标本。进行RNA的提取及鉴定、基因芯片的检测、生物信息学分析、采用Western blot、Northern bLot、荧光定量RT-PCR检测和基因敲除技术对基因芯片检测结果进行验证。结果(1)造模成功判定:与正常组对比,模型组大鼠在行为学、病理学及基因学上有显著变化,造模成功。(2)送检9只大鼠的肺组织中提取的基因,将所得基因结果根据基因库等数据进行剔除,按照p<0.05,以基因表达倍数值的绝对值≥2.0为阈值来确定差异表达基因。结果有统计学意义,这些基因与哮喘的发生发展均有直接或者间接的关系。正常组与模型组A组比较,正常组中下调的17个基因,上调的6个基因,模型组A组呈现相反的变化,有统计学意义,哮喘模型建立成功。正常组和模型组B组、给药组比较,差异表达基因相同,上调基因有4个,下调基因有2个,给药组基因上下调倍数明显高于模型组B组,上调基因和下调基因减少。模型组A组和模型组B组、给药组比较,上调基因有两个,下调基因有6个,给药组基因上下调倍数明显高于模型组B组,模型组A组中上调的基因在模型组B组、给药组中下调,下调的基因不表达或者低表达,模型组B组、给药组出现了两个上调基因,其均有抗炎作用。模型组B组和给药组比较中,无表达下调基因,表达上调基因有8个。结果提示模型组B组自身免疫恢复,给药组用药后免疫恢复,且治疗效果优于模型组B组,尚未恢复到正常状态。(3)将正常组、模型组和给药组的差异表达基因进行比较,通过热图可以发现,正常大鼠的基因表达中通过不同基因的上调和下调或者不表达来维持免疫稳态,模型组和给药组的基因也出现了上调与下调来应对哮喘的发生,差异有统计学意义,发现与哮喘有关的上调基因有18个,下调基因有7个。通过各个基因作用对比分析,实验结果与已经发表的一些相关文献报道一致,也与基因的功能相一致。结论1.差异表达基因与哮喘发生机制的关系:与EOS有关,参与气道炎症形成、气道高反应性、气道重塑过程的基因有:EOS趋化性细胞因子CCR3、Ccl11、Ccl2、Ccl22;有抗炎作用的基因:ADM、Pla2g4c、Fcgr3a、Nr1d1、Acox1;参与气道炎症的基因有:C3、SelP、Sele、Serpina3n、CX3CR1;参与气道炎症和气道重塑的基因有:MMP-9、TLR1;抗气道炎症和气道重塑的基因有:Timp1;与哮喘密切相关,但是尚不清楚发生机制的基因有:prim1、Serpinb10、FMO3、Scd1、per3、DBP、ANKRD1、CD177、DES。2.正常组和模型组A组比较,基因上下调明显,基因与哮喘形成的三种机制均有关系,哮喘模型建立成功,差异有统计学意义。正常组、模型组A组分别和模型组B组、给药组相比,差异表达基因相同,给药组基因上下调倍数高于模型组B组,两组组间比较,差异表达基因全部是上调,无下调基因,说明天灸药物白芥子散治疗哮喘大鼠后,较之模型组A组、B组哮喘情况有所好转,较之正常组仍有哮喘炎症的存在,结果有统计学意义。3.正常情况下,免疫稳态维持大鼠生命的基本状态,哮喘大鼠伴随着免疫稳态的打破,与哮喘相关的基因也发生变化,在热图中可以明显看出基因上下调变化,原本应该上调的基因,转变为下调,原本下调的基因转变为上调,原本不表达或者低表达的基因开始表达,将正常组、模型组和给药组的差异表达基因进行比较,发现与哮喘有关的上调基因有18个,下调基因有7个,通过各个基因作用对比分析,实验结果与已经发表的一些相关文献报道一致,也与基因的功能相一致,在基因上,哮喘大鼠的基因发生了改变,其中部分基因或者基因多态性在在哮喘中明确发挥着重要的作用,能够为治疗哮喘的免疫稳态的重建过程提供一个方向。