研究背景与总体思路肠道是体内最大的贮菌库和内毒素库,但是在正常情况下,肠屏障能阻止肠道内细菌及其分解产物经肠壁扩散至机体内。在严重感染、创伤、休克等应激状况下,肠道屏障功能受损,肠内细菌及内毒素发生易位,肠道内微生物和内毒素可通过受损的肠粘膜屏障侵入到体循环,形成肠源性感染,可导致多器官功能障碍。因此,肠屏障功能已成为判断危重患者预后的重要指标之一。目前人们在肠源性感染的病因和机制方面作了大量研究,而对烧伤及内毒素作用后肠道生物屏障的变化及相关的基因治疗报道较少。因此,如何保护肠黏膜屏障功能成为当前研究领域的热点之一。以前这方面的研究思路主要集中在肠内营养及恢复肠内正常微生态环境上,而利用原癌基因治疗肠黏膜损伤却少有涉及。为此本研究以30%TBSA烫伤大鼠及内毒素损伤大鼠为模型,对烧伤后肠道生物屏障的动态变化及相关基因的表达进行了系统观察,并进行了体外肠上皮细胞培养,观察原癌基因治疗对内毒素性肠上皮细胞的影响。原癌基因丝/苏氨酸蛋白激酶Pim-3,它广泛表达于人类各种组织细胞中,以肾脏、肝脏和胰腺表达较高,可促进MAPK磷酸化,参与多个细胞信号通路的调控。原癌基因丝/苏氨酸激酶Pim-3具有促进细胞生长和抑制凋亡的功能,在损伤组织的修复、治疗中发挥积极作用。所有这些均表明Pim-3有可能与肠道的损伤和功能有着密切的关系。很多原癌基因在肠道黏膜受损后都具有增量调节的作用。例如,c-fos、c-jun、egr-1、sp-1、表皮生长因子、转化生长因子、三叶肽、表皮生长因子受体、肝细胞生长因子、c-met、成纤维细胞生长因子受体、血管内皮生长因子,所有这些基因产物都扮演着一个重要的修补角色,协助修复受损的肠黏膜。这些原癌基因整合的功能和他们的产物,都具备重要的修复特性。基于这一点,本课题将主要研究Pim-3基因对肠黏膜屏障功能即肠上皮细胞损伤修复的影响。为此我们设想,Pim-3可能在急性烧伤大鼠肠屏障功能的损害中发挥作用,并可能作为细胞内的一种内源性保护物质,对减轻烧伤引起的肠粘膜损伤起着重要的保护作用。本实验的总体研究思路为:首先,建立严重烫伤大鼠模型,内毒素处理大鼠模型,通过检测肠道机械屏障标记物之一闭锁蛋白（Occludin）以及细胞间黏附分子（ICAM-1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白介素-6（IL-6）和病理结果及Pim-3 mRNA和蛋白水平,旨在明确①48小时内肠屏障损伤、ICAM-1和Pim-3的表达规律,并分析Pim-3与肠屏障损伤及炎性因子TNF-α、IL-6之间的时效关系,并探讨这些变化的相关性。②分析内毒素和烧伤处理后的动物,相关指标有无统计学差异,为体外试验提供依据。然后,根据上部分的研究结果,以原代肠上皮细胞为研究对象,模拟烧伤时对肠上皮细胞的直接影响,建立内毒素性肠上皮细胞损伤模型。将Pim-3转染入肠上皮细胞用于防治内毒素性损伤,利用RT-PCR检测各项指标Occludin、ICAM-1及IL-6、TNF-α和Pim-3等,并利用流式细胞术观察各组细胞凋亡情况,研究Pim-3对肠上皮细胞的保护作用及对炎症因子表达方式的影响。从细胞和分子生物学水平,探讨Pim-3保护肠上皮细胞损伤的机制。第一部分:（体内试验）急性烧伤大鼠Pim-3基因表达的变化及肠屏障损害的相关研究目的用烧伤仪制做成年大鼠严重烧伤模型（Ⅲ°,30%TBSA）,内毒素处理大鼠模型。通过检测烧伤后48h内不同时段大鼠回肠病理及肠屏障功能损伤等公认指标,采用RT-PCR及western blotting等分子生物学方法检测Pim-3及相关指标的变化,从整体动物水平,研究烧伤后肠屏障的损伤,以及Pim-3的变化。目的在于证实烧伤和内毒素对内源性Pim-3基因在肠道表达的影响及Pim-3基因与肠黏膜损伤的相关性。方法将实验大鼠随机分为三组:A组.烧伤组（n=30）;B组.内毒素（LPS）组（n=30）:C组.正常对照组（n=6）。各组依次在处理后3h、6h、12h、24h、48h取回肠组织,进行常规HE染色做病理切片,提取总RNA及总蛋白,并进行RT-PCR及Western blotting印迹法分别检测内源性Pim-3、Occludin、ICAM-1、IL-6、TNF-α在肠道的表达。结果1、粘膜形态学改变经HE染色可见烧伤后3h绒毛出现水肿,肠粘膜固有层充血、出血,炎性细胞浸润,表皮脱落,以伤后12h损伤最严重,伤后48h肠粘膜病变还未恢复正常;内毒素组伤后6h上述变化加重,以伤后12h变化最明显;烧伤组与内毒素组肠粘膜形态出现了同样改变,正常对照组无明显变化。2、Pim-3的水平:正常大鼠回肠组织Pim-3 mRNA和蛋白水平低表达,烧伤组及内毒素组内源性Pim-3 mRNA和蛋白水平在3小时表达开始增多,6小时到达顶点,12小时开始下降,24小时、48小时低表达。烧伤组、内毒素组内源性Pim-3基因表达与c组之间的差异有统计学意义（p＜0.01）,烧伤组分别为对照组的12.25±1.24,21.13±1.78,14.21±1.12,2.12±0.11,1.08±0.97倍;内毒素组分别为对照组的15.08±2.07,25.24±2.11,16.32±0.23,2.15±1.23,1.10±0.87倍;烧伤组、内毒素组之间的差异无统计学意义（p＞0.05）。3、肠机械屏障的损害:在烧伤组,westernblotting分析证实occludin蛋白水平在3小时和6小时升高。RT-PCR方法示烧伤后3h、6h、12h、24h、48h闭锁蛋白mRNA量升高,分别为对照组的3.25±0.26、6.65±0.24.、3.10±0.8,1.55±0.9,1.01±0.22倍;内毒素组3h、6h、12h、24h、48h分别为对照组的3.15±0.55,6.25±0.56,2.52±0.78,1.42±0.3,1.05±0.2倍(P＜0.05=。内毒素组与烧伤组比较经统计学检验无显著性差异（P＞0.05）。4、ICAM-1的表达:烧伤组、内毒素组ICAM-1 mRNA的表达与对照组之间的差异有统计学意义（p＜0.01）;烧伤组、内毒素组ICAM-1的表达无统计学意义（p＞0.05）烧伤及内毒素处理后ICAM-1 mRNA量增加,以伤后12h升高明显（P＜0.01）。烧伤组3h、6h、12h、24h、48h为对照组的55.12±5.32,82.16±5.68,88.31±7.41,58.16±4.56,56.12±3.89倍;内毒素组3h、6h、12h、24h分别为对照组的37.81±4.48,89.68±6.67,58.43±5.67,53.24±4.36,88.12±6.21倍（P＜0.05）。内毒素组与烧伤组比较经统计学检验无显著性差异（P＞0.05）。5、炎症因子:正常肠组织IL-6、TNF-α无表达。烧伤及内毒素促使IL-6、TNF-α表达。烧伤组TNFα为正常组的30.12±0.87,76.12±5.87,63.27±0.91,59.45±0.65,55.36±0.63倍,差异有统计学意义（p＜0.01）。结论在烧伤大鼠及内毒素作用下大鼠,Pim-3作为内源性保护物质在损伤的肠粘膜中高表达;occludin做为肠道屏障的指标在不同的时间点出现升高和降低;IL-6、TNF-α、ICAM-1的表达出现上调的情况。第二部分:（体外实验）Pim-3保护内毒素性肠上皮细胞损伤机制的初步探讨目的观察Pim-3在内毒素性肠上皮细胞损伤中的保护作用。方法以Wistar乳鼠原代培养的肠上皮细胞加入终浓度为0.5ug/ml的内毒素（LPS）,建立LPS损伤模型。实验分为6组:①正常对照组+内毒素处理组;②空载质粒pEGFP-N₂转染+内毒素处理组;③重组质粒pEGFP-N₂/Pim-3转染+内毒素处理组;④正常对照组;⑤空载质粒pEGFP-N₂转染组;⑥重组质粒pEGFP-N₂/Pim-3转染组。每次实验为复孔,重复4次。内毒素浓度（0.5ug/ml）,内毒素处理6小时后,提取各组总RNA,利用RT-PCR法检测occludin、Pim-3各项指标,并利用流式细胞术观察各组细胞凋亡情况。RT-PCR测定细胞内ICAM-1、IL-6,TNF-α水平。探讨Pim-3保护LPS诱导的肠上皮细胞损伤的机制。结果1、肠上皮细胞损伤:③组的细胞凋亡及occludin、ICAM-1的表达与①②组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）,③组可使细胞凋亡下降、升高occludin蛋白的表达、降低ICAM-1的表达。⑥组的细胞凋亡及occludin、ICAM-1的表达与④⑤组之间的差异无统计学意义（p＞0.05）,而④⑤⑥组之间occludin、ICAM-1的表达差异无统计学意义（p＞0.05）,但是,④⑤⑥组的ICAM-1表达与①②③组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）;2、促炎症因子反应:IL—6与TNF-α:④⑤⑥组之间IL—6与TNF-α无表达;③组的IL—6与TNF-α表达与①②组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）,但是,④⑤⑥组的IL—6与TNF-α表达与①②③组之间的差异有统计学意义（p＜0.05）。结论原癌基因Pim-3除了能抑制肠上皮细胞凋亡,还能够增强occludin的表达,减少ICAM-1、IL—6与TNF-α的表达。