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目的:血脑屏障(BBB)除了限制有害的外源性和内源性分子进入中枢神经系统外,还限制了治疗性药物的进入。极低的血脑屏障透过率是药物递送和治疗效果受限的主要原因。本课题组首次提出“活血利窍,开通玄府,干预血脑屏障促进益脑方药脑靶向作用”的观点,在前期研究中发现,银杏叶提取物与人参提取物配伍,能显著增加大鼠脑组织中人参活性成分的含量,其作用机制与银杏叶提取物调节血脑屏障通透性有关。前期体外研究发现银杏叶提取物的活性成分白果内酯具有较强降低跨内皮细胞电阻的作用。本研究旨在探讨白果内酯对血脑屏障通透性的调节作用及其潜在机制,为进一步研究开发脑靶向新药奠定基础。方法:1、评价白果内酯对体外血脑屏障通透性的作用。采用永生化人脑微血管内皮细胞(hCMEC/D3)与永生化人星形胶质细胞(HEB)共培养体系,建立体外血脑屏障模型。白果内酯给药处理后通过检测跨内皮细胞电阻(TEER)和荧光素钠(Na-F)清除速率评价血脑屏障通透性。2、评价白果内酯对小鼠血脑屏障通透性的作用。小鼠给予不同剂量(2.5、5、10 mg/kg)白果内酯后静注示踪化合物10 kDa FITC-Dextran,荧光定量分析法和免疫荧光法测定小鼠脑组织中FITCDextran的血管渗出量,评价大分子物质的血脑屏障通透性。3、探究白果内酯对hCMEC/D3细胞紧密连接的作用。细胞经白果内酯给药处理后,Western Blot法检测粘附连接蛋白VE-Cadherin、紧密连接蛋白Occludin和Claudin-3的蛋白表达量,透射电镜观察hCMEC/D3细胞间紧密连接的超微结构。4、探究白果内酯对肌动蛋白结合蛋白Ezrin/radixin/moesin(ERM)和Myosin light chain(MLC)的作用。细胞经白果内酯给药处理后,Western Blot法检测细胞ERM和MLC的磷酸化表达。小鼠经白果内酯给药处理后,免疫荧光法检测小鼠脑微血管中ERM和MLC的磷酸化表达。5、探究白果内酯对腺苷受体A1(A1R)的作用。利用siRNA沉默hCMEC/D3细胞的A1R基因,给予白果内酯处理后检测体外血脑屏障模型的TEER、细胞的p-ERM和p-MLC蛋白表达和紧密连接超微结构的变化。结果:1、白果内酯作用于体外血脑屏障模型2 h后,与正常组相比,TEER显著降低(P<0.01),Na-F的清除速率显著增加(P<0.05),说明白果内酯有增加细胞旁路通透性的作用。药物作用4小时后TEER值和Na-F的清除速率恢复至接近正常水平,说明血脑屏障可自行恢复完整性。2、白果内酯(5 mg/kg)给药处理的小鼠脑组织中10 kDa FITCdextran含量显著增加(与对照组比,P<0.05),而血清中FITC-dextran含量无显著性差异。说明白果内酯可增加大分子示踪物的血脑屏障通透性。3、白果内酯给药处理后hCMEC/D3细胞的粘附连接蛋白VECadherin、紧密连接蛋白Occludin和Claudin-3的表达无明显变化(与对照组相比,P>0.05),但细胞间紧密连接超微结构发生改变了。4、白果内酯能显著促进hCMEC/D3细胞的肌动蛋白结合蛋白ERM和MLC蛋白磷酸化。ERM和MLC蛋白分别在给药后1.5和2小时磷酸化水平达到峰值,4小时ERM和MLC均已去磷酸化。同样的,小鼠脑微血管上的ERM和MLC蛋白磷酸化表达也明显上调。5、经siRNA沉默A1R基因后,白果内酯降低TEER、促进ERM/MLC磷酸化和改变紧密连接超微结构的作用被大部分抵消,说明白果内酯调节血脑屏障通透性的作用可能与A1R信号通路有关。结论:白果内酯具有可逆性调节血脑屏障通透性的作用,其作用机制可能通过激活A1R信号通路,促进下游肌动蛋白结合蛋白ERM和MLC蛋白磷酸化,导致细胞骨架重构,改变细胞间紧密连接超微结构,从而增加血脑屏障通透性。本研究为探索安全有效的脑靶向药物提供思路。