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良性前列腺增生症(BPH)是老年男性泌尿外科的常见疾病。前列腺由腺泡和间质两部分组成。BPH组织中，间质与上皮和平滑肌细胞在问质细胞中的比例均明显高于正常前列腺组织，因此BPH是一种以间质增生为主的疾病。前列腺间质主要由平滑肌细胞和成纤维细胞组成。在BPH研究中，一个主要障碍是缺乏合适的细胞模型。由于前列腺间质细胞具有异质性，不同研究者使用的培养体系中，平滑肌和成纤维细胞的比例不同，导致不同研究者的结论常常会出现矛盾。
本实验室以前曾报道过前列腺平滑肌细胞的培养模型，然而，由于平滑肌细胞在体外培养中逆分化为成纤维细胞，即使采用平滑肌细胞选择性培养液，也不能在体外培养中获得纯的前列腺平滑肌细胞。由于平滑肌细胞和成纤维细胞表达不同的活性因子，它们的自分泌和旁分泌作用可以影响前列腺间质和上皮的增殖和分化。因此，获得纯的平滑肌细胞和成纤维细胞，研究两种细胞基因表达的差异性和激素和相关生长因子对其调节作用，为前列腺增生的病因学提供新的思路和靶点，这对于前列腺增生的分子病因学研究具有重要的意义。
近年来越来越多的研究表明，雌激素可能参与了前列腺腺体的自稳调节和间质增生的形成。转化生长因子β1(TGFβ1)是一种具有多功能生物学活性的细胞因子，它不但在调节细胞的生长、分化、凋亡、胚胎发生和组织修复、炎症反应及纤维化中起着重要的作用，而且对前列腺细胞黏附、细胞外基质合成与蓄积有着重要的调节作用。基质金属蛋白酶是一类在生理条件下能降解细胞外基质和基底膜组分的蛋白，在前列腺不同类型细胞中，基质金属蛋白酶存在差异表达。基质金属蛋白酶．2(MMP-2)是前列腺间质中主要表达的一种基质金属蛋白酶。有研究表明，在鼠前列腺中雄激素可以抑制TGFβ1及其受体的表达；在前列腺癌中，雄激素对多种基质金属蛋白酶的表达有促进作用。有报道指出，在BPI{患者血清和前列腺组织中，基质金属蛋白酶2(MMP-2)的蛋白水平升高，由于老年男性血浆和前列腺组织中雌/雄激素比例和雌激素受体均明显增加，在增生的前列腺中的TGFβ1表达明显增加，因此研究雌激素和TGFβ1对前列腺问质细胞MMP-2的调节作用对进一步了解前列腺增生发生和发展的分子机制有重要的意义。辅助调节因子是类固醇激素和配体结合后募集的转录调节因子，辅助调节因子包括辅助激活因子和辅助抑制因子，分别对类固醇激素受体的转录活性具有上调或下调作用，从而调节细胞的增殖、分化、凋亡等生物学表型。雄激素受体辅助调节因子ARA55最初克隆自人前列腺cDNA文库，它可以与AR相互作用，还与许多细胞内蛋白(比如热休克蛋白hsp27，酪氨酸激酶PYK2等)结合，并调节不同的信号传导途径。
另有文献报道，TGFpl可以上调ARA55的表达。我们发现在不表达雄激素受体的前列腺癌细胞系DU．145中有ARA55的表达，而且过表达ARA55可以抑制DU-145细胞的增殖。由于TGFβ1可以抑制前列腺癌细胞增殖，探讨在不表达雄激素受体的DU-145细胞中ARA55的作用及其与TGFβ1的关系，可为进一步阐明类固醇激素受体辅助调控因子表达异常在前列腺癌病变发生、发展中的作用机制提供重要的线索。
方法：论文第一部分，克隆SM22启动子，并构建不同长度的SM22启动子调节的荧光素酶报告质粒，通过测定用平滑肌细胞选择性培养液和普通间质细胞培养液培养的前列腺间质细胞中的荧光素酶活性，选择具有平滑肌细胞特异性而且具有较高活性的SM22启动子片断。将平滑肌细胞特异性的SM22启动子片断克隆到红绿荧光报告载体中，在此载体上，红色荧光蛋白(RFP)的表达受平滑肌细胞特异性的SM22启动子片断的调控，绿色荧光蛋白(GFP)受CMV启动子控制，是组成型表达的。我们采用了基于启动子特异性激活红绿色荧光蛋白表达，并采用流式细胞分选的策略，用流式细胞仪分选出GFP+/RFP+和GFP+/RFP-细胞，即纯的平滑肌细胞和成纤维细胞。而后，提取总RNA，进行实时定量RT-PCR，并研究基因表达差异。
论文第二部分，体外培养前列腺平滑肌细胞系WPMY-1，添加入不同浓度的雌激素和TGFβ1，用实时定量RT-PCR方法分别测定TGFβ1和MMP-2的mRNA水平的表达，并用ELISA的方法测定培养液中TGFβ1的蛋白水平，用酶谱电泳的方法测定MMP-2的活性。克隆MMP-2基因的启动子调节的荧光素酶报告基因，瞬时转染前列腺平滑肌细胞系WPMY-1，并进行启动子活性分析，研究转录水平的调节作用。用TGFβ1中和抗体阻断TGFβ1信号途径，研究雌激素和TGFβ1对于MMP-2表达的分子机理。用放线菌素D和放线菌酮处理细胞，分别阻止mRNA和蛋白的合成的方法研究TGFβ1对于MMP-2表达的分子机理。
论文第三部分，用RT-PCR的方法测定不同类型的前列腺细胞系和前列腺癌与癌旁组织中一些类固醇受体辅助调节因子(包括AIB1，ARA54，ARA55，ARA70，BRCAl，CBP，NCOR1，P68，P300，PCAF，SMRT，SRA，SRCl，TIF2等)的mRNA水平的差异表达情况。选定前列腺癌细胞系中表达低的ARA55为研究对象，克隆其基因表达载体和小干扰RNA表达载体，建立稳定转染ARA55的前列腺癌细胞系DU-145。采用MTT的方法研究ARA55过表达对DU-145增殖的影响。采用实时定量RT-PCR和ELISA的方法分别测定TGFβ1的mRNA水平和蛋白水平。采用TGFβ1中和抗体阻断TGFβ1信号途径，研究ARA55抑制DU-145细胞系增殖的分子机理。克隆TGFβ1的启动子，采用荧光素酶报告基因研究ARA55对TGFβ1启动子的作用。
结果：论文第一部分，成功克隆了SM22启动子，并连接到荧光素酶报告质粒中，测定不同长度截短的SM22启动子用平滑肌细胞选择性培养液和普通间质细胞培养液培养的前列腺间质细胞中的活性。结果表明，SM22转录起始点到上游-1396bp的SM22启动子片断具有平滑肌细胞特异性而且具有较高的活性。将构建的红绿荧光蛋白的表达载体转染原代前列腺间质细胞，部分细胞同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白，部分细胞只表达绿色荧光蛋白，这分别代表成功转染的前列腺平滑肌细胞和成纤维细胞。通过流式细胞仪，可以在体外分离同时表达红色荧光蛋白和绿色荧光蛋白的细胞群和只表达绿色荧光蛋白的细胞群。实时定量RT-PCR结果表明，经流式细胞仪分离的细胞为纯的平滑肌细胞和成纤维细胞。而且，雌激素受体和TGFβ1在前列腺平滑肌细胞中的表达比成纤维细胞高10倍以上。
论文第二部分，雌激素和TGFβ1均可以促进体外培养的前列腺平滑肌细胞系WPMY-1的MMP-2蛋白水平的表达，但对MMP-2的mRNA水平没有影响。进一步研究其作用机制发现，雌激素可以促进TGFβ1的表达，而且雌激素对MMP-2蛋白水平的促进作用可以被TGFβ1中和抗体阻断，提示，雌激素对MMP-2蛋白水平的促进作用是通过TGFβ1实现的。进一步研究TGFβ1对MMP-2上调的作用机制结果表明，TGFβ1不能促进MMP-2的启动子活性，而且，TGFβ1对于MMP-2表达的促进作用可以被放线菌酮抑制，但不能被放线菌素D抑制，提示，TGFβ1对于MMP-2表达的促进作用是转录后调节的机制。
论文第三部分，在本文研究的类固醇受体辅助调节因子中，ARA55的表达水平在前列腺癌细胞系中明显低于非癌细胞系；在前列腺癌组织中表达水平低于癌旁组织。提示，ARA55的表达下调与前列腺癌相关。分别克隆了ARA55的基因和小干扰RNA表达载体，并建立了ARA55的基因和小干扰RNA表达载体稳定转染的前列腺癌DU-145细胞系。MTT结果表明，ARA55过表达可以抑制DU-145细胞的增殖。实时PCR的结果显示，TGFIβ1可以上调ARA55的表达：ELISA结果显示，ARA55过表达可以促进TGFβ1的表达；而且ARA55对DU-145增殖的抑制作用可以部分被TGFβ1中和抗体阻断，提示，ARA55抑制增殖的作用是部分通过TGFβ1而实现，但可能还有其他途径。
结论：用基于平滑肌细胞特异性标记蛋白SM22启动子特异性激活荧光蛋白表达并在体外采用流式细胞仪的方法可以成功的分选前列腺平滑肌细胞和成纤维细胞；比较分离的前列腺平滑肌细胞和成纤维细胞基因表达差异结果表明，雌激素受体和TGFβ1主要在前列腺平滑肌细胞中表达，提示，雌激素受体和TGFβ1在维持前列腺平滑肌细胞的表型中具有重要作用。
阐明了雌激素通过促进TGFβ1的表达并以转录后调节的方式上调体外培养前列腺平滑肌细胞系WPMY-1的MMP-2蛋白水平的分子机制，提示，雌激素促进前列腺间质增生和抑制前列腺癌的转移方面有一定的作用。
ARA55在前列腺癌中低表达；TGFβ1可上调ARA55的表达，ARA55又可通过促进TGFβ1的表达部分抑制前列腺癌细胞系DU-145的增殖。提示ARA55在前列腺癌中不是以雄激素辅助调节因子的作用方式，而是与TGFβ1形成正反馈的调节模式部分抑制前列腺癌细胞的增殖。