论文部分内容阅读
前期研究报道了昆虫血细胞表面存在有功能活性的hemichannel,能进行细胞内与细胞外的信号转导和物质交流。这种特殊的细胞表面通道蛋白最早被发现于脊椎动物,命名为connexin,后来在无脊椎动物中也发现这类蛋白,称为innexin (invertebrate connexin, innexin)。一个hemichanel由六个innexin蛋白构成,而每一个innexin蛋白则包含了四个跨膜结构域(Transmembrane domain, TM)、两个胞外环、一个胞内环以及C-端结构域和N-端结构域。本论文延续前期的工作,深入研究构成hemichannel的功能基因innexin,首次从斜纹夜蛾Spodoptera litura血淋巴中克隆得到innexin2(Spli-inx2)和innexin3(Spli-inx3)基因,其中，Spli-inx2编码359个氨基酸(amino acid, aa),蛋白分子量为41.5kDa; Spli-inx3编码386个氨基酸,蛋白分子量为43.8kDa。软件预测表明,两者均有四个跨膜结构域；序列比对及系统进化树的构建,表明我们获得的Spli-inx2和Spli-inx3基因,属于保守的innexin基因家族。本研究成功构建了Spli-inx2和Spli-inx3基因的真核表达载体pIZT/V5-His-Spli-inx2和pIZT/V5-His-Spli-inx3,并转染至Hi5、Sf9、Spli221和Bm12四个鳞翅目昆虫细胞系,利用融合蛋白标签V5抗体进行Western blot检测,结果表明,Spli-inx2和Spli-inx3基因均能在四种细胞中表达,且细胞免疫荧光的实验进一步确定SpliINX2和SpliINX3蛋白主要分布在细胞质和细胞膜。SpliINX2和SpliINX3蛋白在不同的细胞系表达后,表现出不同的细胞生理变化。在Hi5细胞中,通过使用博莱霉素(zeocin),成功地筛选了稳定表达SpliINX2和SpliINX3蛋白的细胞系Hi5-Inx2和Hi5-Inx3,并提取稳定表达细胞系的膜蛋白,利用融合蛋白标签V5抗体进行Western blot检测,结果表明,SpliINX2和SpliINX3蛋白能够正确定位到细胞膜表面,而深入的dye uptake实验表明定位于膜表面的SpliINX2和SpliINX3均能形成功能性的hemichannel;在同源细胞系Spli221中未能建立稳定表达细胞系；在表达了SpliINX2和SpliINX3蛋白的Sf9细胞出现了凋亡特征；Bm12细胞则出现了明显的聚集现象。上述研究结果初步表明,SpliINX2和SpliINX3蛋白形成hemichannel,传递细胞信号,其通路可能与细胞聚集、细胞凋亡途径相关。