【摘 要】
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[背 景]药物成瘾是一种慢性的脑部疾病,长期大量吸食海洛因会造成严重的神经损伤如轴突变形、脱髓鞘改变等,进一步加重吸毒者的认知及记忆功能障碍甚至导致痴呆。目前,一般的实验技术难以动态观察成瘾后活体内的神经元损伤和轴突运输。[目 的]利用锰离子增强磁共振成像（manganese-enhanced magnetic resonance imaging,MEMRI）动态监测海洛因成瘾后不同阶段的大脑轴突
【基金项目】
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国家自然科学基金（81960496）； 云南省教育厅科学研究基金研究生项目（2021Y342）《影像动态侦测海洛因复吸成瘾大鼠异常的脑区活动及轴突运输》； 昆明医科大学2020年研究生创新性基金（2021S065）《海洛因所致大鼠神经退行性改变的ME-MRI研究》； 国家自然科学（地区）基金项目（
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[背 景]药物成瘾是一种慢性的脑部疾病,长期大量吸食海洛因会造成严重的神经损伤如轴突变形、脱髓鞘改变等,进一步加重吸毒者的认知及记忆功能障碍甚至导致痴呆。目前,一般的实验技术难以动态观察成瘾后活体内的神经元损伤和轴突运输。[目 的]利用锰离子增强磁共振成像（manganese-enhanced magnetic resonance imaging,MEMRI）动态监测海洛因成瘾后不同阶段的大脑轴突转运功能,进一步探究导致海洛因复吸模型大鼠认知障碍和轴突运输能力下降的原因。[方法]本研究方案获得昆明医科大学第三附属医院伦理委员会批准,所有动物实验程序均符合有关动物护理和使用的机构指南。自昆明医科大学实验动物中心购买成年Sprague-Dawley雄性大鼠60只,采用随机数字法将大鼠分入4组,分别是短期生理盐水对照组（简称“短期对照组”,n=15）,长期生理盐水对照组（简称“长期对照组”,n=15）,短期复吸大鼠组（简称“短期组”,n=15）和长期复吸大鼠组（简称“长期组”,n=15）。海洛因复吸方式如下:向大鼠腹腔内注射海洛因溶液,首次剂量为3 mg/kg,按体重逐日递增3 mg/kg,连续9天至剂量达到27 mg/kg,随后大鼠进行10天的自然戒断以帮助戒毒。短期组接受3次吸毒-戒毒周期,长期组接受6次吸毒-戒毒周期,同期对照组仅注射相同次数和剂量的生理盐水。通过注射纳洛酮溶液,在30分钟内观察大鼠的戒断症状,判断是否成功建立了海洛因生理依赖模型。戒断症状包括清理皮毛、齿颤、跳跃、扭体、湿狗样抖、站立等行为,记录戒断症状出现的次数进行评分。利用Morris水迷宫（MWM）评估海洛因对大鼠学习记忆的影响,使用智能红外线跟踪系统记录游泳速度、游泳路径、在目标象限花费的时间和穿越平台的次数。水迷宫结束后进行MEMRI扫描,根据图像中Mn2+信号的变化计算轴突运输速率、动态评估大鼠的海马轴突运输功能。利用Western blotting检测轴突结构和认知功能相关蛋白的表达。透射电镜观察大鼠海马区的线粒体、轴突、突触等超微结构变化。免疫荧光染色分析突触素核蛋白水平。所获得数据采用SPSS 22.0统计软件进行分析,各组数据用均数±标准误表示。独立样本t检验检验分析两组大鼠之间的显著差异,两两比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）比较,采用重复测量方差分析对三组在水迷宫训练试验中的逃避潜伏期数据进行分析。P＜0.05认为差异具有统计学意义。图像用Sigmaplot 14.0 和 Origin 8.0 软件进行制作。[结 果]1.建立海洛因生理依赖模型纳洛酮属于阿片受体的拮抗剂,能阻断阿片类药的作用,因此纳洛酮常用于阿片类药物的戒断,本实验观察到注射纳洛酮催促成瘾大鼠出现明显的戒断症状,短期组戒断评分为14.16±1.32,长期组戒断评分为15.30±0.82,明显高于同期对照组的评分2.5±0.83;2.3±0.76（P＜0.001）,证明海洛因生理依赖大鼠模型已成功建立。2.大鼠进行MWM训练以探讨海洛因对记忆和认知功能的影响定向航行实验中,各组大鼠寻找水下平台的时间随着训练天数的增加而减少,但长期组大鼠的逃避潜伏期仍高于短期组与对照组（P＜0.001）。在探针实验中,撤离平台后,短期组和长期组大鼠的跨越次数和平台区象限停留的时间与对照组相比均明显减少（P＜0.05）,而游泳速度在各组之间没有显著差异,提示海洛因会导致大鼠的学习和记忆功能发生改变。3.MEMRI显示大鼠的轴突转运功能与对照组相比,短期组大鼠在海马和丘脑Mn2+转运速率加快（P＜0.001）。长期组大鼠对Mn2+的摄取和转运能力严重不足;与对照组大鼠相比,其轴突转运率显著降低（P＜0.001）。4.各组病理学检测结果（1）突触、微管结构指标:与对照组相比,短期组大鼠的SYN、PSD-95、β-Tubulin水平减少（P＜0.05）,Tau的含量下降（P＜0.01）;与对照组相比,长期组中的 SYN、PSD-95、Tau、β-Tubulin均明显下降（P＜0.001）（2）认知功能相关指标:与对照组相比,短期组大鼠的BDNF无明显变化,TrkB略升高（P＜0.01）,CREB蛋白的表达量减少（P＜0.05）;与对照组相比,长期组大鼠的BDNF、TrkB、CREB显著降低（P＜0.001）（3）超微结构的变化:透射电镜显示海洛因暴露会导致大鼠脑超微结构异常。短期组大鼠神经元细胞轻度水肿、细胞膜完整,而长期组出现神经元细胞中-重度水肿,核皱缩凹陷;线粒体肿胀,嵴断裂,多数细胞器均肿胀,突触数量减低、结构被破坏。（4）免疫荧光染色:海洛因诱导短期、长期复吸模型大鼠中SYN的染色强度均显著降低（P＜0.05）。[结 论]1.海洛因成瘾后不断复吸,会导致大鼠中枢神经系统损伤,并且伴随严重的学习和记忆功能障碍;2.锰离子增强磁共振成像可以无创、动态地监测海洛因依赖大鼠脑部的轴突转运功能,为评估药物成瘾性脑病提供了新的研究方向;3.BDNF-CREB信号通路的破坏和轴突损伤,可能是造成海洛因复吸大鼠认知障碍的重要原因。
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