细胞色素P450（cytochromeP450,CYP）超家族酶系,参与内、外源性物质的代谢、失活及活化。CYP超家族酶系主要表达在肝脏,但近年来的研究发现CYPs也表达于肝外器官,如脑。研究证实,脑CYPs可原位代谢或活化具有中枢活性的外源性药物和毒物。在脑内,不同CYP亚型表达量存在明显差异,且不同脑区、不同神经细胞类型所表达CYP亚型不同。依据mRNA水平分析,脑内表达的主要 CYP 亚型包括,CYP46A1,CYP2D6,CYP2E1,CYP2J2,CYP2U1 和CYPIB1。依据免疫蛋白杂交实验分析,CYP46A1仅表达于神经元,CYP2D6,CYP2E1,CYP2J2和CYP2U1表达于神经元和星形胶质细胞,CYPIB1主要表达于小胶质细胞。细胞膜磷脂可在磷脂酶的作用下代谢生成花生四烯酸（Arachidonicacid,AA）,AA可进一步代谢产生超过100种以上的衍生物,是细胞完成一些重要生物学功能的物质基础。AA主要通过三条途径进行代谢:（1）环氧化酶（cyclooxygenases,COX）代谢途径;（2）脂质氧化酶（lipoxygenase,LOX）代谢途径;（3）CYPs代谢途径。CYPs所催化的花生四烯酸代谢反应,又可分为:（1）类丙烯氧化反应,主要代谢产物为羟基二十碳四烯酸（Hydroxyeicosatetraenoicacid,HETE）,包括5-,8-,9-,11-,12-,15-HETE;（2）ω和ω-l羟化反应,主要代谢产物为19-,20-HETE;（3）环氧化反应,主要代谢产物为环氧二十碳三烯酸（epoxyeicosatrienoicacid,EET）,包括 5,6-,8,9-,11,12-,14,15-EET。EETs 经过可溶性的表氧化物水解酶（soluble epoxide hydrolase,sHE）水解成无生物活性的稳定代谢物。在外周,参与AA代谢的CYP亚型包括CYPIA、CYPIB、CYP2B、CYP2C、CYP2E、CYP2J、CYP2U、CYP4A、CYP4F。然而,目前对于脑 CYPs在AA的代谢网络中的生物学行为所知甚少。谷氨酸是人类中枢神经系统重要的兴奋性神经递质,参与多种中枢神经系统生理功能的调节。星形胶质细胞是大脑中数量最多的一类神经细胞,是进行谷氨酸-谷氨酰循环的重要场所。目前,研究发现在星形胶质细胞上存在谷氨酸受体的表达,提示谷氨酸可能影响星形胶质细胞的神经生理功能。本文拟通过离体和在体实验,利用分子生物学和分析化学的方法,深入研究谷氨酸对人脑内表达量较高且具有催化AA代谢功能的CYPs的调控作用。研究结果将为进一步认识神经递质调控脑CYPs介导的AA代谢变化提供重要数据基础。第一部分:谷氨酸调控脑CYP2J及其介导的花生四烯酸环氧化物类代谢物目的:谷氨酸是大脑中主要的兴奋性神经递质,且谷氨酸兴奋毒性参与多种神经退行性疾病的病理生理学过程。已知,星形胶质细胞上存在代谢型受体mGluR3和mGluR5,而mGluR5可能在维持谷氨酸稳态中的具有重要作用。CYP2J为重要的肝外表达CYP亚型,已被证实在AA的环氧化物EETs代谢过程中发挥着重要的作用。EETs可作为自分泌或者旁分泌因子,对炎症、血管紧张性等具有发挥调控作用。本部分拟研究谷氨酸对脑CYP2J及其介导的EETs代谢产物的影响。方法:采用人胶质母细胞瘤U251细胞系,给予不同浓度（10-50μM）谷氨酸处理24 h,利用定量RT-PCR检测mGluR5和CYP2J2 mRNA水平。采用mGluR5和MAPK（ERK,JNK,p38）特异性抑制剂预处理U251细胞系30 min,然后给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用定量RT-PCR检测CYP2J2 mRNA水平,考察mGluR5以及MAPK是否参与谷氨酸对CYP2J的调控作用。给予MAPK特异性抑制剂预处理细胞30 min后,给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测CREB与CYP2J启动子结合能力。在U251细胞系共转染CREB表达质粒及含CYP2J2启动子的荧光报告基因重组质粒,检测CREB对CYP2J2启动子的调控作用。Wistar大鼠按照两雌一雄进行交配,待动物分娩后,将新生鼠随机分为对照组和谷氨酸处理组,于1、3、5、7 d皮下注射预先配制的谷氨酸溶液（4mg/g）。出生后10周,断头处死雄性动物,分离不同脑区（海马,小脑,额叶皮层,脑干）,测定不同脑区mGluR5和CYP2J2 mRNA水平,以及EETs和DHETs水平。采用DMEM衍生化处理EETs和DHETs,制备不同代谢物各自的标准品。采用LC-MS/MS法检测不同脑区EETs和DHETs水平,并利用PLS-DA分析统计不同脑区代谢物的差异。结果:体外实验中,与对照组相比,谷氨酸呈时间及剂量依赖性调控CYP2J2mRNA水平。给予MPEP预处理,可逆转谷氨酸对CYP2J2的诱导效应,提示mGluR5介导谷氨酸对CYP2J2的调控作用。与对照组相比,谷氨酸处理可以上调ERK1/2,p38和JNK磷酸化蛋白水平。U251细胞系分别给予ERK1/2（U0126）,p38（SB202190）,以及JNK（SP600125）的特异性抑制剂预处理30min后,能明显拮抗谷氨酸上调CYP2J2mRNA的诱导效应。染色体免疫共沉淀实验发现,谷氨酸（50μM）可增加CREB与CYP2J2启动子的结合,较对照组上升1.78倍。然而,给予ERK1/2（U0126）,p38（SB202190）,JNK（SP600125）特异性抑制剂可抑制 CREB与CYP2J2启动子的结合。在整体动物实验中,初生小鼠给予谷氨酸处理,可使得成年动物mGluR5水平在额叶皮层、海马、小脑、脑干分别上调1.49倍,3.82倍,1.46倍,1.41倍。实验结果提示,幼年时期大剂量谷氨酸暴露,可导致mGluR5上调,进而引起谷氨酸系统的持续活化。同时,谷氨酸处理动物CYP2J3表达水平在额叶皮层、海马、小脑、脑干分别上调2.21倍,8.27倍,1.5倍和3.53倍。经PLS-DA分析,海马与小脑,额叶皮层和脑干的EETs和DHETs的代谢物含量有显著区别。分别对不同脑区的EETs及DHETs进行了统计,幼年暴露谷氨酸可致成年动物额叶皮层、海马、小脑、脑干EETs和DHETs总量上调1.16倍,1.18倍,1.18倍和1.19倍。结论:谷氨酸可时间及剂量依赖性诱导脑CYP2J表达,并影响脑内EETs的生成。谷氨酸可通过星形胶质细胞上的受体mGluR5,激活MAPK信号通路（ERK1/2,p38和JNK）分子,进而增加CREB与CYP2J2启动子的结合,上调CYP2J。第二部分:谷氨酸调控脑CYP1B1和CYP2U1及其介导的花生四烯酸羟基类代谢物目的:形态学证实星形胶质细胞是功能性神经血管单元（neurovascular unit,NVU）的重要组成部分。血管内皮细胞和星形胶质细胞共同组成基膜屏障,且内皮细胞、周细胞与星形胶质细胞的终足紧密连结。以往研究表明,CYPIB1和CYP2U1在星形胶质细胞中高表达,且在新鲜分离的人脑微血管中,CYPIB1和CYP2U1为唯一可被检测出的CYP亚型。实验证实,CYPIB1可将AA代谢成为中链羟基二十碳四烯酸（HETEs）和末端羟基类HETEs等。同时,CYP2U1可以将AA代谢为19-HETE和20-HETE。鉴于花生四烯酸的多种代谢物具有血管调控活性,本部分拟在前期实验的基础上,进一步研究谷氨酸对脑CYPIB1和CYP2U1的调控作用以及HETEs代谢水平的影响。方法:采用人胶质瘤母细胞U251细胞系和永生化人脑微血管内皮细胞系hCMEC/D3,给予不同浓度（10-50 μM）谷氨酸处理24 h,利用定量RT-PCR检测CYPIBI和CYP2U1 mRNA水平。采用mGluR5和MAPK（ERK,JNK,p38）特异性抑制剂预处理U251细胞系30 min,然后给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用定量RT-PCR检测CYPIB1和CYP2U1 mRNA水平,考察mGluR5以及MAPK是否参与谷氨酸对CYPIB1和CYP2U1 mRNA的调控作用。给予MAPK特异性抑制剂预处理细胞30 min后,给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测CREB与CYPIB1和CYP2U1启动子的结合能力。在U251细胞系共转染CREB表达质粒及含CYPIB1和CYP2U1启动子的荧光报告基因重组质粒,检测CREB对CYPIB1和CYP2U1启动子的调控作用。Wistar大鼠按照两雌一雄进行交配,待动物分娩后,将新生鼠随机分为对照组和谷氨酸处理组,于1、3、5、7d皮下注射预先配制的谷氨酸溶液（4mg/g）。出生后10周,断头处死雄性动物,分离不同脑区（海马,小脑,额叶皮层,脑干）,测定不同脑区CYPIB1和CYP2U1 mRNA水平,以及HETEs水平。采用DMEM衍生化处理HETEs,制备不同代谢物各自的标准品。采用LC-MS/MS法检测不同脑区HETEs水平,并利用PLS-DA分析统计不同脑区代谢物的差异。结果:体外实验结果显示,谷氨酸（10,25,50 μM）可剂量依赖性上调U251和hCMEC/D3两种细胞系中CYPIB1和CYP2U1 mRNA表达水平。在U251细胞系中,与对照组相比,50μM谷氨酸分别使得CYPIBI和CYP2U1 mRNA水平上升1.68倍和1.80倍;同时,在hCMEC/D3细胞系中,CYPIB1和CYP2U1 mRNA水平分别提高了 1.79倍和1.34倍。在U251细胞系中,分别给予MAPK特异性抑制剂U0126,SB202190,SP600125以及mGluR5特异性抑制剂MPEP,可显著抑制谷氨酸对CYPIB1和CYP2U1 mRNA的诱导作用。与对照组相比,谷氨酸（50 μM）处理U251细胞系15 min,ERK,p38,JNK磷酸化蛋白水平上调。但是,谷氨酸激活的MAPK通路可被mGluR5特异性抑制剂（MPEP）所拮抗。细胞免疫荧光结果表明,CREB蛋白主要存在于细胞核内,谷氨酸可上调胞核中磷酸化CREB水平。给予mGluR5特异性抑制剂MPEP,可显著抑制谷氨酸诱导CREB蛋白磷酸化的过程。同时ChIP实验证实,谷氨酸可促进CREB与CYPIB1和CYP2U1的启动子结合,而MPEP能减弱CREB与启动子的结合量。与对照组相比,接受皮下注射谷氨酸单钠的大鼠,成年后额叶皮层、海马、小脑和脑干CYP1B1 mRNA水平分别升高1.65 倍,1.53 倍,1.58 倍和 1.54 倍;CYP2U1 mRNA 水平分别升高 1.31 倍,1.82倍,1.47倍和1.56倍。经PLS-DA分析,海马与小脑,额叶皮层和脑干的HETEs的代谢物含量有显著区别。与对照组相比,谷氨酸处理组5-,8-,11-,12-,和15-HETE总量在额叶皮层、海马、小脑和脑干分别上升了 1.15倍,1.12倍,1.13倍和1.10倍。其中,在额叶皮层、海马、小脑和脑干中,谷氨酸处理组5-HETE生成量均显著上升。与对照组相比,谷氨酸处理动物额叶皮层、海马、小脑和脑干中,19-和20-HETE生成总量分别增加1.12倍,1.21倍,1.17倍和1.10倍。尽管在所测脑区中,19-HETE生成量没有变化,但20-HETE生成量均明显上升。结论:结果表明,突触外低浓度谷氨酸可以通过星形胶质细胞CYPIB1和CYP2U1,改变AA的羟基类代谢产物。谷氨酸通过星形胶质细胞中mGluR5偶联的MAPK-CREB信号通路,上调CYPIB1和CYP2U1表达。结合第一部分实验数据,谷氨酸可能通过调控脑CYPs水平影响中枢AA代谢。虽然神经元是否通过星形胶质细胞调控脑血流量仍需进一步研究,但是本文证实星形胶质细胞所表达CYPs是参与中枢神经系统AA代谢的重要路径,且受到神经递质谷氨酸调控。