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禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)能引起禽类高死亡率给养禽业的发展带来重大危害。存在于APEC中的PhoP/Q二元调控系统是由菌体外膜蛋白PhoQ感应外界环境变化,继而将信号传递给PhoP,PhoP能够调控病原菌毒力基因表达,这对菌体侵袭机体上皮细胞导致机体致病起着关键作用。探索PhoQ介导PhoP调控的APEC毒力基因靶点,针对APEC检测受PhoP调控的外膜蛋白、内毒素等毒力相关基因,为后续进一步明确PhoP/Q调控系统对APEC毒力的影响奠定了基础。为探讨由PhoQ介导的PhoP对毒力基因的调控作用,本实验从基因调控角度入手通过禽致病性大肠杆菌phoP/Q基因的原核表达获得其蛋白产物,检测受PhoP蛋白调控的毒力相关基因;同时,得到了PhoQ蛋白为实验室对PhoQ的研究提供了材料。本实验为后续进一步研究PhoP/Q二元调控系统对禽致病性大肠杆菌毒力的调控功能和作用机理提供一些参考。具体内容和结果如下:1禽致病性大肠杆菌PhoP/Q蛋白的表达根据NCBI中报道的APEC phoP/Q基因编码区序列(GenBank登录号CP000468.1),分别设计phoP(5′、3′端分别添加EcoR I和Xho I酶切位点)和phoQ引物(5′、3′端分别添加EcoR I和Hind III酶切位点,本文中所提PhoQ均为膜外区)用于扩增phoP/Q基因片段,将得到的phoP/Q基因片段克隆到PMD19-T载体上,经酶切和测序验证后分别将PMD19-T-phoP/Q和pET32a进行双酶切连接,成功构建pET32a-phoP/Q原核表达载体并转化大肠杆菌BL21(DE3)。将测序正确的E.coli BL21(DE3)-pET32a-phoP/Q接种于LB液体培养基,IPTG诱导表达PhoP/Q重组蛋白,SDS-PAGE检测分子量分别为42.9 KDa和34.43 KDa,与其理论分子量相一致。2禽致病性大肠杆菌PhoP/Q蛋白的纯化及鉴定工程菌经诱导表达,进一步证实重组的PhoP蛋白属于胞内可溶性表达,后期选择30℃经0.5 mmol/L IPTG诱导过夜后离心取菌体沉淀,冰浴超声破碎取上清过Ni-NTA亲和层析柱纯化PhoP蛋白,将纯化的目的蛋白进行SDS-PAGE和1D-LC-MS质谱分析,结果显示成功表达PhoP重组蛋白。PhoQ蛋白是一个经过两次跨膜的膜蛋白,前期全序列难以表达,后期选择表达PhoQ蛋白的膜外功能区。借鉴PhoP蛋白的表达纯化方法,PhoQ条件摸索后确定为37 0.5 mmol/L℃IPTG诱导过夜后取LB上清进行纯化,纯化后经过SDS-PAGE验证最终得到PhoQ蛋白的胞外功能区,为实验室后续实验做准备。3禽致病性大肠杆菌PhoP蛋白与毒力基因的相关性分析在Genbank上查找目的基因启动子区序列,通过生物信息学分析对PhoP蛋白与DNA的结合基序(启动子区)进行预测,利用凝胶迁移实验(EMSA)验证PhoP蛋白能够结合的基因启动子,最终检测出可能受PhoP调控的宿主菌外膜蛋白、内毒素等毒力相关基因分别为iss血清毒力基因、mgtA镁离子转运相关基因、chuA外膜血红蛋白受体基因、uspA应激反应基因、sly B外膜脂蛋白基因、hlyF溶血基因。本实验成功构建了pET32a-phoP/Q表达载体,分别获得胞内可溶性PhoP蛋白和分泌型表达PhoQ蛋白的工程菌,并利用凝胶迁移实验验证了表达的PhoP重组蛋白具有选择结合基因启动子的活性,建立了检测PhoP重组蛋白调控宿主菌DNA的方法。同时,PhoQ膜外功能区蛋白的成功表达为PhoQ的后续功能研究提供了一些基础。以上结果表明,PhoP/Q二元调控系统对APEC的毒力有着关键的调控作用。本研究为进一步探究PhoP/Q二元调控系统对APEC的调控作用提供一些研究依据。