背景自然杀伤/T细胞淋巴瘤（natural killer/T cell lymphoma,NKTCL）是一种罕见的非霍奇金淋巴瘤（NHL）,发病机制尚不清楚。由于NKTCL肿瘤细胞复杂的多药耐药机制（multidrug resistance,MDR）,以蒽环类为基础的化疗方案在NKTCL中治疗的临床结局较差。新的治疗策略包括含L-天冬酰胺酶的方案,局部放疗,序贯化疗和放疗,同步放化疗（concurrent chemoradiotherapy,CCRT）,能显著的改善结果。然而,与早期疾病患者相比,晚期患者的总生存率（Overall Survival,OS）较差。因此晚期复发难治性NKTCL患者仍迫切需要新的治疗方案。CD30抗原是肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factor,TNFR）超家族的成员之一,在被激活的T、B、NK淋巴细胞可见CD30的表达。在自然杀伤（natural killer,NK）/T细胞淋巴瘤中也有CD30的表达。维布妥昔单抗是一种CD30靶向抗体-药物偶联物（antibody-drug conjugate,ADC）。维布妥昔单抗在霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的临床研究显示了良好的抗肿瘤效果,已被批准用于晚期霍奇金淋巴瘤和间变性大细胞淋巴瘤的治疗。苯达莫司汀是一种氮芥类抗肿瘤药物,具有烷基化作用破坏DNA合成。常被用于滤泡性淋巴瘤和其他惰性淋巴瘤的一线治疗。苯达莫司汀联合维布妥昔单抗在霍奇金淋巴瘤治疗也陆续获得显著的效果。免疫疗法目前已经成为是一种有前途的治疗方法。靶向治疗如抗CD30,维布妥昔单抗单药已经被证明在NKTCL临床治疗中是有效的。因此,了解维布妥昔单抗在NKTCL中的作用机制,探索更为安全有效的免疫靶点治疗方案,对提高治愈率、延长患者的生存期尤为重要。目的通过一系列体内外实验探索维布妥昔单抗单药或联合苯达莫司汀对NKTCL的抑制作用,为维布妥昔单抗联合苯达莫司汀在血液肿瘤领域的应用进行补充,更是为临床NKTCL患者提出新的治疗方案提供实验基础和理论依据。方法1、通过流式细胞术、Western Blotting等方法检测NKTCL细胞株CD30的表达情况。2、CCK-8法分别检测单药维布妥昔单抗和苯达莫司汀对NKTCL细胞株的抑制作用,并计算出各细胞株在两药联合作用48小时时最佳的协同浓度。3、通过流式细胞术分析,运用 Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody,PE抗体检测维布妥昔单抗与细胞抗原的结合率。4、通过流式细胞术检测维布妥昔单抗和苯达莫司汀作用48小时后NKTCL细胞株的细胞凋亡和细胞周期各期百分比改变。5、通过CCK-8法检测五个NKTCL细胞株对甲基奥瑞他汀E的敏感性。6、通过Western Blotting检测维布妥昔单抗和苯达莫司汀导致细胞凋亡相关蛋白的表达变化、细胞周期G2/M周期阻滞相关蛋白变化、苯达莫司汀作用后CD30表达改变、维布妥昔单抗联合苯达莫司汀在DNA损伤信号通路中相关蛋白变化。7、在荷瘤NKTCL小鼠体内检测维布妥昔单抗和苯达莫司汀联合对肿瘤生长的抑制作用,并通过免疫组织化学染色检测各组肿瘤内Ki-67、cleaved-caspase 3、CD30阳性率的变化。结果1、CCK8结果表明,维布妥昔单抗和苯达莫司汀单药均能抑制NKTCL细胞株的增殖,呈时间和药物剂量依赖性。YT、NKYS、KAI3细胞株在维布妥昔单抗和苯达莫司汀作用48小时后的半抑制浓度分别为:①YT:苯达莫司汀160±2.33μmol/L、维布妥昔单抗:108.7±4.94ng/ml;②NKYS:苯达莫司汀:15.3±4.94μmol/L、维布妥昔单抗:80±1.1 ng/ml;③KHYG-1:苯达莫司汀:24.78±3.95μmol/L、维布妥昔单抗:37.57±7.87μg/ml;④KAI3:苯达莫司汀:34.53±1.686μmol/L维布妥昔单抗:640±8.79ng/ml。2.根据Chou-Talalay方法运用CompuSyn软件计算出NKTCL细胞株在不同IC20、IC30组合浓度的维布妥昔单抗和苯达莫司汀联合时的协同系数,并获得协同系数最小的一组联合浓度,得出每种细胞株处理48小时后的最佳协同浓度;①KAI3:维布妥昔单抗80ng/ml联合苯达莫司汀15μmol/L;②NKYS:维布妥昔单抗80ng/ml联合苯达莫司汀15μmol/L;③KHYG-1:维布妥昔单抗20μg/ml联合苯达莫司汀20μmol/L.3.维布妥昔单抗联合苯达莫司汀促进NKTCL细胞株的凋亡,结果显示苯达莫司汀加入后,联合组总凋亡率与单药组总凋亡率相比明显增加,差异具有统计学意义,Western Blotting结果表明细胞凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3的表达也明显增加。4.维布妥昔单抗单药使NKTCL发生G2/M周期阻滞,流式细胞术结果显示:苯达莫司汀具有协同维布妥昔单抗G2/M期周期阻滞的作用,与单药组相比联合组G2/M期比例上升且差异具有统计学意义。Western Blotting结果表明细胞G2/M周期阻滞相关蛋白p-CDC25C和p-CDC2表达增加、CDC2和CyclinB1表达下降。5.CCK-8法分别检测五个NKTCL细胞株在24h,48h对甲基奥瑞他汀E的敏感性,其中YT、KAI3、KHYG-1对MMAE敏感性最高,NKL,NKYS对MMAE的敏感性次之。6.使用 Goat anti-Human IgG Fc Secondary Antibody,PE抗体流式检测 ADC药物与细胞表面的抗原的结合率,与细胞表面的CD30的表达程度一致,CD30表达越高,维布妥昔单抗的结合率越高,细胞凋亡杀伤作用越显著。7.NKTCL荷瘤小鼠体内实验观察到维布妥昔单抗联合苯达莫司汀治疗后,瘤体体积均明显缩小,与两个单药组相比,两药联合更加有效抑制肿瘤生长。经免疫组化染色显示,各个用药组Ki-67表达下调,联合组Ki-67下调显著,提示肿瘤细胞增殖能力显著降低。Cleaved-caspase 3增多,表明肿瘤在两药联合作用下诱导凋亡增加。CD30阳性肿瘤细胞减少说明了维布妥昔单抗和苯达莫司汀联合作用下,能有效杀伤靶细胞。8.Western Blotting结果显示苯达莫司汀不会影响CD30抗原的表达,不影响维布妥昔单抗发挥靶向作用。维布妥昔单抗联合苯达莫司汀的Westrn Blotting结果表明DNA损伤标志性蛋白p-H2A.X和DNA损伤修复标志性蛋白p-ATM和p-CHK1表达均增强,提示维布妥昔单抗增强苯达莫司汀DNA损伤作用,两者联合具有协同作用。结论1.维布妥昔单抗和苯达莫司汀联合协同诱导NKTCL发生G2/M期阻滞,增强诱导细胞调亡,抑制NKTCL细胞增殖,在体内外发挥协同抗肿瘤作用。MMAE对NKTCL肿瘤细胞具有较强的细胞毒性作用,经过抗体特异性靶向结合,维布妥昔单抗更能高效靶向杀伤NKTCL肿瘤细胞。2.Western Blotting结果表明两药联合加剧NKTCL细胞DNA损伤,进而诱导细胞凋亡来发挥协同抗肿瘤作用。