论文部分内容阅读
严重急性呼吸综合症(severeacuterespiratorysyndrome，SARS)又称传染性非典型肺炎(infectiousatypicalpneumonia)，它可以通过家庭和医护人员感染，是一种新出现的传染病。回顾性的流行病学调查表明，2002年11月发生在我国广东省佛山市的一宗非典型肺炎为首发病例，世界卫生组织(WHO)于2003年7月6日报告最后一例受感染的SARS病例，该病爆发到2003年7月止，全世界已有29个国家和地区发现病例，全球累计感染人数达8098人，累计死亡人数为774人。该病流行的地区，社会经济受到沉重打击，特别是国际旅游业；另外，也直接影响到卫生服务事业。
为了确定传染性非典型肺炎(SARS)患者病原体种类。本研究用超薄切片电镜技术观察广东省传染性非典型肺炎流行早期3例死亡病例尸解肺组织标本，用RT-PCR法扩增尸解肺组织和SARS病人咽嗽液中SARS冠状病毒特异核酸片段，并进行序列测定。结果在死亡病人肺组织中观察到衣原体的网状体、中间体以及原体颗粒，并见衣原体包涵体样结构；用RT-PCR法在2例尸解肺组织扩增出预期大小的DNA片段，测序后经相似性(BLAST)比较，与SARS冠状病毒相应基因片段高度同源；用巢式RT-PCR技术在SARS病人咽漱液中扩增出SARS冠状病毒特异基因片段。说明RT-PCR技术可以用于SARS患者的临床诊断，同时证实SARS患者有SARS-CoV的感染，部分患者合并衣原体等微生物混合感染。
为了分离鉴定传染性非典型肺炎的病原体。本实验采集急性期病人的咽拭子或漱口液，用Vero、VeroE6、MDCK、Hela、Hep-2等传代细胞、人胚肺二倍体细胞(HEL)和人胚肺(HP)等细胞系统分离培养病原体，用超薄切片电镜技术、间接免疫荧光试验、中和试验、RT-PCR和序列测定等方法鉴定所分离到的病毒。结果用Vero、VeroE6、MDCK和HP细胞从标本中分离到一株病毒。间接免疫荧光试验发现，SARS恢复期病人血清可与病毒起反应，在胞膜和胞浆中出现翠绿色荧光；中和试验结果表明，SARS恢复期病人血清能中和病毒对细胞的致细胞病变作用；电镜下可观察到冠状病毒样颗粒；RT-PCR法可扩增到冠状病毒特异性基因片段，且其核苷酸序列与国内外发表的SARS冠状病毒相应的基因序列相符，同源性达到100％。从而证实从传染性非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS冠状病毒，这种病毒与传染性非典型肺炎密切相关。
冠状病毒属基因组中大约含有30000个核昔酸，是目前已知最大的RNA病毒，有包膜，为单正链RNA病毒，在宿主细胞的胞浆中复制。SARS冠状病毒(SARS-CoV)全基因组有29751个碱基组成，从5～3端有5个主要开放读码框(ORF)，分别编码RNA聚合酶蛋白(复制酶1a，1b)、刺突蛋白(SpikeProtein，S蛋白)、包膜E(EnvelopeProtein，E蛋白)、膜蛋白(MembraneProtein，M蛋白)和核衣壳蛋白(NucleocapsidProtein，N蛋白)，其顺序和大小均与其他冠状病毒相似。其中，碱基序列26398～27063nt被推测编码病毒221aa的包膜(M)糖蛋白，BLAST和FASTA分析显示M蛋白是SARS-CoV的主要包膜基质糖蛋白。它与S蛋白相连，是形成病毒包膜的基本步骤，同时也加速了病毒的装配，作为连接核衣壳和病毒包膜的桥梁，与E蛋白与衣壳之间的相互作用引起经感染细胞膜结构出芽的过程；M蛋白不仅在病毒包膜中大量存在，而且在被感染的细胞膜上也大量存在，M蛋白能诱导抗体依赖补体介导的病毒中和作用。有报道M蛋白中存在B细胞和T细胞表位，所以M蛋白可能介导了SARS-CoV的特异体液免疫和细胞免疫应答，可作为SARS疫苗研究的候选抗原。
本研究成功地用大肠杆菌BL21(DE3)表达了SARS-CoVM蛋白质，表达出的融合M蛋白质Mr约为52000，正好是Mr均为26000的SARS-CoVM蛋白质和GST蛋白质的融合。在实验中发现通过降低诱导表达温度(28℃)以及增加通气量，可以使诱导的M蛋白不以包涵体的形式存在，并且可以分泌表达，同时获得较高的表达量(34.8％)。本研究获得了SARS冠状病毒GST-M融合蛋白，用Westernblot和ELISA分析发现它可与SARS患者的恢复期血清产生特异性的结合反应。
本研究将RT-PCR扩增出的M基因克隆到巴氏毕赤酵母表达载体pPICZαB，电穿孔法将重组体整合入酵母菌P.pastorisX-33，经抗生素Zeocin筛选产生的转化子进行表型鉴定，取Mut+菌用甲醇诱导表达，SDS-PAGE检测其表达产物。Mut+酵母转化菌经甲醇诱导可分泌表达约65kDa和42kDa的蛋白质，与SARS恢复期病人血清的免疫印迹和ELISA证实它们为特异的重组M蛋白。
本研究同时用上述表达的SARS-CoVM蛋白分别免疫Balb/c小鼠，发现两种M蛋白均能刺激小鼠相应的体液免疫应答和细胞免疫应答；即均具有免疫原性，可以作为亚单位疫苗的候选；但这两种蛋白抗原性存在差异。
总之，本实验就是在运用电镜法和RT-PCR等技术检测SARS患者病原的基础上，成功地分离出SARS-CoV。并证实RT-PCR可用于临床检测SARS-CoV，Vero-E6细胞株是分离培养SARS-CoV好的细胞模型。然后，用RT-PCR技术扩增出SARS-CoVM基因，通过大肠杆菌的表达系统和巴斯德毕赤酵母表达系统成功地表达了SARS-CoVM蛋白；并发现它们均有较特异的免疫反应性；同时用表达的M蛋白免疫Balb/C小鼠，研究M蛋白的免疫原性；这些为进一步研制SARS-CoV亚单位疫苗和建立快速诊断方法打下了基础。