胚胎干细胞是一类来源于早期胚胎,在体外培养条件下具有自我更新和多向分化潜能的细胞。无限增殖和分化形成成体各类组织细胞的能力使其受到再生医学等领域的广泛关注。1981年Evans和Martin等人从小鼠胚胎中成功分离第一株小鼠胚胎干细胞,多年之后人、猴子和大鼠等不同物种的胚胎干细胞也相继成功建立。猪是一种重要的家畜,其在生理、解剖结构和免疫等方面与人有很大的相似性,建立猪胚胎干细胞也受到了广泛关注。过去的30多年间虽然有很多猪胚胎干细胞系被建立,但以生殖系嵌合发育能力为判定标准进行衡量,那么猪胚胎干细胞建系工作目前仍未成功。PeNK6细胞系是本实验室建立的猪早期胚胎来源的多能干细胞系,该细胞有着类似人胚胎干细胞的特征,呈扁平样克隆、表达核心转录因子,体内体外分化实验均可以获得典型的三胚层组织。Pe NK6细胞系中多能性相关信号通路如LIF/STAT3、FGF、WNT和PI3K等的激活情况在实验室前期工作中已被阐明,但关于TGF-β信号的激活情况和作用却尚未得到充分的研究。TGF-β信号通路在小鼠和人胚胎干细胞多能性维持中发挥着重要的作用,但在大型家畜胚胎来源干细胞中的作用仍存在争议。在猪早期胚胎来源干细胞中系统性地阐明TGF-β信号通路与多能性调控关系的报道很少,因此有必要深入地研究猪多能性干细胞中TGF-β信号通路在多能性调控中的作用。在本研究中我们通过单细胞测序和免疫蛋白印迹方法证明了TGF-β信号通路在Pe NK6细胞系中呈激活状态。对猪早期胚胎不同发育阶段RNA-Seq数据的分析发现,猪早期囊胚内细胞团中TGF-β信号通路活性较低,而发育至晚期囊胚其活性则逐渐上调。据此,我们推测在Pe NK6中抑制TGF-β信号可能会对Pe NK6细胞系的多能性有积极影响。因此本次研究通过在Pe NK6细胞系的培养体系(KO培养液)中添加小分子抑制剂SB431542和A83-01抑制TGF-β信号通路活性,检测Pe NK6细胞系的各类生物学指标的变化,从而评判TGF-β信号通路对Pe NK6细胞系生物学特征的影响。研究结果表明,TGF-β信号被抑制后,PeNK6的核心转录因子SOX2和初始态多能性相关因子KLF4,KLF5和TFCP2L1显著上调。同时激发态多能性因子DNMT3B显著下调,这表明抑制TGF-β信号通路后Pe NK6的多能性特征发生改变,表现为部分多能性基因表达模式由激发态转变为类似初始态。同时,抑制TGF-β信号通路对PeNK6细胞系的分化能力也产生影响。抑制TGF-β信号通路后,Pe NK6细胞系的拟胚体形成能力增强;拟胚体(Embryoid body,EB)尺寸和直径均显著提高。在相同的诱导分化条件下,抑制TGF-β信号通路条件下形成的EB中三胚层标记物表达水平整体低于对照组。以上结果表明,抑制TGF-β信号通路能够改善分化条件下猪类胚胎干细胞拟胚体的形成能力。另外,本次研究在TGF-β信号通路抑制培养体系KO+SB/KO+A中,利用5.5天的猪体外受精胚胎建立了新的多能性干细胞系。该细胞系在多能性因子表达模式上与Pe NK6细胞系在TGF-β通路抑制后具有较高的相似性,体外分化形成EB的能力优于Pe NK6,这进一步证实了抑制TGF-β信号通路对猪胚胎干细胞多能性具有积极影响。综上所述,本次研究结果表明,TGF-β信号通路在猪多能性干细胞中具有重要的生物学作用,抑制该信号通路对猪多能性干细胞的多能性相关特征具有正向影响。本次研究为深入理解TGF-β信号通路在猪胚胎干细胞多能性调控中的作用提供了详实的实验证据,对于建立具有生殖系嵌合发育能力的猪初始态胚胎干细胞系具有重要的参考价值。