【摘 要】
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氮素是植物生长发育必须的营养物质之一,约占植物干重的5%,在有机体中多以氨基酸、多肽以及蛋白质等形式存在。大豆是一种重要的经济和栽培作物,种子中含有丰富的植物蛋白及多种人体必需氨基酸。大豆与土壤根瘤菌建立的共生固氮体系能够帮助植物将空气中不能被植物直接吸收利用的无机氮（N2）转化为可被植物吸收的有机氮。氨基酸转运蛋白在植物体内各类氨基酸的转运、利用以及应对生物与非生物胁迫中发挥重要作用,但关于氨基
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氮素是植物生长发育必须的营养物质之一,约占植物干重的5%,在有机体中多以氨基酸、多肽以及蛋白质等形式存在。大豆是一种重要的经济和栽培作物,种子中含有丰富的植物蛋白及多种人体必需氨基酸。大豆与土壤根瘤菌建立的共生固氮体系能够帮助植物将空气中不能被植物直接吸收利用的无机氮（N2）转化为可被植物吸收的有机氮。氨基酸转运蛋白在植物体内各类氨基酸的转运、利用以及应对生物与非生物胁迫中发挥重要作用,但关于氨基酸转运蛋白在大豆结瘤固氮调控网络中发挥的作用鲜有报道。本研究利用9种具有全基因组数据的代表植物基因组,通过生物信息学和分子生物学的研究手段,深入分析了被子植物LHT基因家族的进化机制,同时探讨了该基因家族在大豆中的功能分化;并利用百脉根遗传转化技术结合亚细胞定位,探讨了大豆LHT基因在结瘤中的作用。主要结果如下:（1）在选取的9种被子植物代表物种中共含有114个LHT同源基因,大豆中含有25个,内含子数目1-9;进化分析表明被子植物LHT基因家族划分为7个亚家族I-VII,其中II的成员最多,III为单子植物特有;编码的大豆氨基酸数量为56-543aa,相对分子量为（6.3-57.1）×10~3,理论等电点为6.03-9.51,均为跨膜蛋白。（2）通过对大豆LHT基因家族成员在染色体上的定位和共线性分析,鉴定出8对旁系同源基因,发现大豆LHT基因家族中64%的同源拷贝是由WGD或串联重复造成,暗示LHT基因家族在大豆进化的过程持续扩张,并且其扩张与全基因组重复密切相关。通过对8对旁系同源基因Ka/Ks的估算,发现Ka/Ks均小于1,表明较强的净化选择在全基因组复制后基因功能的分化中发挥着关键作用。（3）利用转录组分析大豆中Gma LHTs表达模式,可以将其分为两类:一是组织特异性表达基因,另一类是在所有被检测组织中表达量都较低的基因。利用q RT-PCR分析Gma LHTs在被瘤菌侵染的大豆组织样本的表达模式,发现该基因家族的表达受到根瘤菌侵染的诱导,在根瘤侵染后部分成员在根或根瘤中特异性表达。大豆Gma LHT家族基因表达模式在不同亚家族的差异表明其在进化过程中受到选择,其中跨膜结构对其功能的完整性具有至关重要的作用。（4）利用转录组数据热图分析结合q RT-PCR分析,大豆Gma LHT17在根瘤中表达量较高,推测其可能在大豆结瘤过程中发挥重要功能;Gma LHT18在接种根瘤菌的大豆叶组织中表达量较高,其可能在植物生长过程中承担重要角色;而Gma LHT24在所有组织中的表达量均较低。（5）对Gma LHT17、Gma LHT18、Gma LHT24蛋白质功能预测,发现α-螺旋是蛋白质的主要组成部分,均为疏水性蛋白质,无信号肽结构,其中LHT18和LHT24含有较多的磷酸化位点。Plant-Ploc预测可能在Gma LHT17、Gma LHT18、Gma LHT24可能位于细胞膜、高尔基体、叶绿体上行使其转运功能。（6）利用农杆菌介导的转基因技术,将其转入豆科模式植物百脉根中来研究其对结瘤的影响。统计超表达Gma LHTs基因百脉根毛根的结瘤数目,经统计发现,在百脉根毛根中过表达Gma LHT17、Gma LHT18可以显著增加百脉根毛根的结瘤数目,但Gma LHT24可以显著减少百脉根毛根结瘤数目。推测这些基因可能参与一些调控途径,影响结瘤固氮调控网络,进而对结瘤能力产生影响。（7）构建e YFP基因与Gma LHTs基因融合表达载体,用农杆菌侵染洋葱表皮细胞,在洋葱中表达融合表达蛋白。将Gma LHT17和Gma LHT24转入洋葱表皮细胞,在荧光显微镜下观察其行使功能的位置,发现其定位于细胞质膜上。推测其功能与氨基酸转运进/出细胞相关。综上,我们的研究结果将为大豆LHT基因家族的进一步研究提供重要参考,同时也将为氨基酸转运蛋白的研究提供新思路。以上研究结果为今后定向改良大豆氨基酸转运能力、提高大豆的结瘤固氮效率提供重要的基因信息和理论基础。
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