弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种危害严重的人畜共患寄生虫,宿主范围广泛,能感染几乎所有的温血动物,给养殖业和公共卫生安全带来极大的威胁。弓形虫生活史复杂,可分为有性生殖阶段和无性生殖阶段,无性生殖阶段包括引起急性感染的速殖子阶段和在组织中缓慢生长的缓殖子阶段。在药物或宿主机体免疫等压力下,速殖子分化为缓殖子以抵御外界压力,当这种压力消失后缓殖子能再度活化为速殖子,引起急性弓形虫病。除此之外,缓殖子还是连接无性生殖与有性生殖的重要桥梁。目前的治疗药物都只对速殖子有效而对缓殖子的作用极其有限,因此宿主一旦感染弓形虫就很难被彻底清除。已有的研究结果表明缓殖子的分化与细胞周期密切相关,但是虫体是如何响应环境信号调控细胞周期等生命活动而启动对应的生长发育程序并不清楚。单磷酸腺苷（AMP）激活的蛋白激酶（Adenosine 5’-monophosphate（AMP）-activated protein kinase）是真核生物中广泛存在的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,由一个α催化亚基和两个调节亚基β、γ组成,参与细胞的能量代谢和稳态调控。本研究鉴定了弓形虫中AMPK复合物的组成形式,对复合物中的β亚基进行深入研究发现它参与弓形虫细胞周期和生长发育的调控。主要研究结果如下:（1）弓形虫AMPK复合物的鉴定以及各亚基间相互作用的验证以酵母和人的AMPKα亚基序列在弓形虫基因组数据库中搜索,发现一个高度同源性的AMPKα亚基（Tg AMPKα）。以Tg AMPKα为诱饵蛋白进行免疫共沉淀和蛋白质谱分析（Co-IP/LC-MS）,发现了潜在的Tg AMPKβ亚基和Tg AMPKγ亚基。分别利用潜在的Tg AMPKβ和Tg AMPKγ为诱饵蛋白,再次进行Co-IP/LC-MS进一步鉴定AMPK复合物的成份。结果显示,以任何一个亚基为诱饵均能捕获到高丰度的另外两个亚基肽段。通过体外蛋白互作实验进一步验证了AMPKβ与Tg AMPKα和AMPKγ均存在相互作用。这些结果表明:弓形虫中Tg AMPKα、Tg AMPKβ、Tg AMPKγ组成一个AMPK复合物。（2）Tg AMPKβ在Ⅱ型虫株ME49的生长发育中扮演关键角色利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建了ME49Δampkβ虫株。对其深入研究发现,缺失Tg AMPKβ后,虫株表现出明显的生长缺陷并自发地分化为缓殖子。通过细胞周期检测,发现当敲除Tg AMPKβ后弓形虫细胞周期进程异常,DNA的复制减慢并被阻滞在G1期,且DNA损伤比例显著增加。这些结果表明在正常情况下,Tg AMPKβ参与了弓形虫的细胞周期的调控,影响弓形虫的生长发育。在短期碱性压力环境下,ME49Δampkβ虫株全部分化为机能异常的缓殖子,5天后虫体逐渐死亡。这表明Tg AMPKβ对速殖子的维持及碱性环境下的生存至关重要。对细胞分裂进程进行检测,发现碱性压力下缺失Tg AMPKβ后虫体的内生殖分裂方式变得混乱无序,甚至出现类似裂殖生殖期特有的多元内生殖分裂方式。这些结果表明:在碱性环境下,Tg AMPKβ对维持虫体正常的分裂繁殖方式非常重要。小鼠感染实验表明ME49Δampkβ虫株在小鼠体内无法生存进而导致其毒力显著下降。（3）Tg AMPKβ对Tg AMPKα在应激环境下的磷酸化非常重要对不同环境下Tg AMPKα的磷酸化水平进行检测发现,在正常培养条件下胞内ME49虫体内Tg AMPKα的磷酸化水平很低,碱性诱导能迅速提高虫体中Tg AMPKα的磷酸化水平。当敲除Tg AMPKβ后,Tg AMPKα的磷酸化不再响应应激变化。另一方面,无论是正常还是应激条件下,Ⅰ型虫株RH中Tg AMPKα的磷酸化水平都很低。在RH虫株中敲除Tg AMPKβ后发现,敲除Tg AMPKβ对Tg AMPKα的磷酸化和虫体的生长分化均没有明显影响。这些结果表明Tg AMPKβ通过影响Tg AMPKα的磷酸化水平调控虫体细胞周期进程和生长发育,而对失去分化能力的虫体几乎没有影响。（4）Tg AMPK在转录和蛋白修饰水平调控靶基因的活性从而调控虫体细胞周期和生长发育进程通过互作蛋白质组学分析,发现大量与Tg AMPKβ互作的蛋白被注释到转录后修饰。鉴于Tg AMPKβ对Tg AMPKα的磷酸化的调控,随后对ME49与ME49Δampkβ两个虫株进行了磷酸化组学检测。对磷酸化差异基因进行KEGG分析,发现大量遗传信息处理相关蛋白的磷酸化水平在两个虫株中呈显著差异。此外,Tg AMPKβ缺失后大量转录调控相关因子如AP2、ZFP家族蛋白的磷酸化水平发生显著变化,这其中包括已被证实参与细胞周期调控的因子Tg AP2IX-5。Tg AMPKβ可能通过调节转录因子的磷酸化而调控虫体的细胞周期及生长发育。通过比较ME49与ME49Δampkβ虫株的转录组数据,发现敲除Tg AMPKβ后大量的缓殖子期特异性基因（BAG1、EON1、ANK1等）在未经过碱性胁迫的条件下大量表达,这解释了它为何自发分化成缓殖子。本研究聚焦弓形虫Tg AMPK复合物的β亚基,通过反向遗传学、蛋白互作组学、磷酸化组学、转录组学等方法发现弓形虫Tg AMPK通过调控众多靶基因的转录和翻译后修饰进而调控虫体的细胞周期和生长发育进程。本研究对理解弓形虫生长发育的调控机制和新型疫苗的开发等防控手段具有重要的意义。