背景:抗癌化疗药物雷替曲塞(Raltitrexed)是一种特异性胸苷酸合成酶(thymidylate synthetase,TS)抑制剂,临床数据表明其在晚期结直肠癌、胃癌、食管癌、恶性胸膜瘤、乳腺癌等多种实体恶性肿瘤中有一定疗效。因为雷替曲塞毒副作用及临床有效率仍不高等原因,其在临床中应用受到了限制。构建靶向药物投递系统,在血循环中缓慢释放药物,并将抗肿瘤药物特定靶向至肿瘤组织,能够有效降低药物毒副作用,并提高药物在肿瘤局部的浓度,进一步提高药物的抗肿瘤效益。红细胞作为药物载体具有良好的生物相容性、生物可降解性、体内循环时间长、资源丰富、易获得、极大变性能力等优势。目的:1、载雷替曲塞红细胞载药系统的构建。2、载雷替曲塞红细胞载药系统进行体外评价。3、载雷替曲塞红细胞抗肿瘤作用的体外评价。方法:1、采用已有的低渗预膨胀技术并加以改良,通过尝试不同的雷替曲塞浓度、预膨胀红细胞数量、与药物作用时间,来摸索、寻找最佳的载药条件及载药效率。2、通过实时观察红细胞在载药前、中、后的形态变化以及检测在这过程中红细胞膜渗透脆性的改变来评价载药过程对红细胞形态、红细胞膜结构和功能是否有影响。将载雷替曲塞红细胞放置在生理盐水中,然后储存于4℃环境中,每天定时肉眼大体观察上清液的颜色,同时在显微镜下观察红细胞的形态,并且随即检测上清液中雷替曲塞的药物浓度,多种方式来评价载雷替曲塞红细胞的储存稳定性。将载雷替曲塞红细胞重悬在PBS液中,随后置于37℃环境中,定时检测离心后的上清液及载药红细胞中雷替曲塞的药物浓度,根据检测结果,将其绘制成“时间-药物浓度”曲线,了解载药红细胞在37℃环境中对包载的雷替曲塞的释放情况。3、通过MTT法评价本实验构建的载雷替曲塞红细胞对肿瘤细胞的增殖抑制作用。将不同浓度的裸药雷替曲塞作用于人结肠腺癌细胞株SW480,经过24h及48h的相互作用后测定OD值,计算细胞增殖抑制率,与载同等雷替曲塞浓度的红细胞作用于SW480细胞24h及48h的细胞增殖抑制率相比较。结果:1、通过对已有的低渗预膨胀法进行改良,构建雷替曲塞红细胞的载药系统,最终获得的最大载药效率约为69.81%,所需条件为:(1)雷替曲塞浓度为0.1 mg/mL;(2)以生理盐水为媒介的雷替曲塞溶液与预膨胀红细胞作用时间为30min。2、在高倍镜下观察包载雷替曲塞前、中、后红细胞形态,在这过程中红细胞形态均无明显变化。将载雷替曲塞红细胞重悬于生理盐水中,并将其置于4℃环境中,7天内肉眼观察上清无明显溶血现象出现,且上清雷替曲塞浓度基本测不出。对比洗涤红细胞、空载红细胞以及雷替曲塞载体红细胞,雷替曲塞载体红细胞膜渗透脆性有一定的增加,但无统计学差异(P>0.05)。载雷替曲塞红细胞对其包载的药物具有稳定释放的能力,完全释放时间大约在48h左右。3、载雷替曲塞红细胞与SW480细胞共培养24h、48h后,载药红细胞与同等浓度裸药雷替曲塞相比,细胞增殖抑制率更强,两者差异有统计学意义(P<0.05)。而产生相同抑制率时,雷替曲塞载体红细胞所需要的雷替曲塞剂量比裸药雷替曲塞少。结论:1、通过对低渗预膨胀技术的改良,建立载雷替曲塞红细胞载药系统,包载效率可达到69.81%左右。载体红细胞形态、红细胞膜结构和功能在包载过程中未受明显影响。2、在4℃环境中,载雷替曲塞红细胞能稳定储存7天。在37℃环境中载体红细胞能缓慢释放包载的雷替曲塞,完全释放大约需要48h左右。3、在体外与人结肠腺癌细胞株SW480共培养,载雷替曲塞红细胞较裸药有持续抗肿瘤作用,且在相同浓度时,共培养24h、48h后的细胞增殖抑制作用强于裸药雷替曲塞。