本研究拟用本中心建立的视网膜母细胞瘤细胞系SO-Rb50研究PEDF对Rb的作用：包括：1)PEDF对SO-Rb50是否也有诱导分化的作用2)PEDF对SO-Rb50是否具有直接抑制和促凋亡的作用3)PEDF是否能下调SO-Rb50血管增生因子一血管内皮生长因子VEGF的表达。从而从体外水平证实PEDF对视网膜母细胞瘤的治疗价值，为RB保守治疗提供一种新的思路。 一、研究目的 通过从体外水平观察PEDF对SO-Rb50分化、增殖、凋亡及VEGF表达的的作用初步了解PEDF治疗视网膜母细胞瘤的潜在价值，为Rb保守治疗提供一种新的安全有效的途径。 二、实验方法 1、通过倒置显微镜和免疫组化方法观察50ng/ml PEDF对SO-Rb50细胞分化的作用，从形态学和免疫标志方面来鉴定PEDF对其诱导分化作用。 2、通过MTT法来检测PEDF对SO-Rb50增殖的影响，设置0、6.25、12.5、25、50、100、200nM PEDF处理浓度。 3、通过PI和Annix V-FITC法检测200nM PEDF对SO-Rb50凋亡的影响，同时设置阴性对照组(0 nM PEDF)和阳性对照组VCR。 4、通过RT-PCR和免疫组化法检测在常氧和低氧条件下PEDF对SO-Rb50VEGF表达的影响。 三、实验结果 1、用含50ng/ml的PEDF培养处理7天后，将SO-Rb50细胞接种于用多聚赖氨酸处理的六孔板中，细胞开始贴壁生长，细胞变扁平，体积变稍大。自接种第1天开始细胞呈单层贴壁或局部小团状或花环状生长，细胞逐渐由圆形向梭形生长，伸出伪足样细小的突起，成团生长的细胞于边缘处见细胞伸出突起。随着培养时间的延长，突起逐渐变粗变长；而对照组仅在贴壁早期部分出现突起，中晚期并无继续分化的趋势。诱导前后SO-Rb50细胞均表达NSE和NF-200，分化后的细胞较分化前表达明显增强。 2、用含6.25、12.5、25、50、100、200nMPEDF的培养液孵育SO-Rb50细胞48小时后，MTT检测各处理组平均OD值分别为1.099±0.147、1.190±0.147、1.344±0.452、1.102±0.351、1.007±0.269、1.037±0.175，各浓度处理组与对照组(1.030±0.090)相比无明显差异(p>0.05)，PEDF对RB细胞增殖作用与PEDF浓度也无剂量依赖性关系(F=1.257，p>0.05)。 3、采用Annix V-FITC/PI双染法检测处理24小时后的各样本凋亡数，结果见200nM PEDF处理组早期凋亡和晚期凋亡细胞总分数约为3.3﹪左右，与阴性对照组(约2.5﹪)相比无明显差异，凋亡分期也无明显差别，而与阳性对照组(约为14.1﹪)相比，有明显差异。 4、RT-PCR结果显示在常氧条件下未加PEDF和加入不同浓度的PEDF处理后的Rb50细胞均表达VEGF基因，25nM、100nM、400nM PEDF处理组相对灰度值分别为0.2709±0.0911、0.2507±0.0898、0.2919±0.0941，与对照组(0.2626±0.1008)相比VEGF表达均未见明显差异(p>0.05)，且各PEDF处理浓度组间VEGF表达也无明显差异(p>0.05)。 而在低氧条件下VEGF较常氧表达是增强的(p<0.01)，如在低氧条件下同时加入100nM PEDF处理的Rb细胞VEGF表达量与不加PEDF处理的对照组相比是减弱的(p<0.05)。 免疫组化结果显示常氧条件加入100nM PEDF培养的细胞VEGF表达量较对照组减弱(p<0.001)，低氧条件下可见VEGF表达较常氧增强(p<0.001)，而同时加入100nM PEDF的VEGF表达量较未加入也是减弱的(p<0.001)。 三、结论 1、PEDF可以诱导SO-Rb50细胞向神经元细胞分化，伴有神经元标志NSE和NF-200表达的增强。 2、PEDF并无直接抑制SO-Rb50细胞增殖和诱导其凋亡的作用。 3、PEDF可以抑制SO-Rb50 VEGF的表达，包括在常氧和低氧条件下，而在低氧条件下更为明显。 综上所述，在体外水平，PEDF对SO-Rb50主要是诱导分化和抑制VEGF表达的作用。视网膜母细胞瘤VEGF水平是增强的尤其在缺氧坏死区周围，因此我们在体外水平的研究结果可以推测PEDF很可能通过诱导分化和抑制肿瘤血管的作用而起到抑制视网膜母细胞瘤的作用。