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目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有l 200 000妇女发生乳腺癌,500000妇女因乳腺癌死亡。北美和欧洲等发达国家是乳腺癌的高发区。据统计,美国妇女9个人中将有1人在其一生中患乳腺癌。亚洲是乳腺癌的低发区,但乳腺癌的发病率逐年升高,且有年轻化趋向。PTBP1属于heterogeneous nuclear ribonucleoproteins(hnRNPs)家族成员,可在RNA代谢的许多方面发挥多种功能。PTBP1对于调控可变剪接、IRES介导的翻译起始以及提高多种转录本的稳定性都是至关重要的。PTBP1细胞定位和它与多种因子的相互作用决定了其功能的多样性。已有研究报道与正常组织相比,PTBP1在乳腺癌组织中高表达,在细胞系检测中同样发现PTBP1在乳腺癌细胞系中高表达,PTBP1能促进乳腺癌细胞的生长和侵袭,但具体机制目前尚不清晰。PTEN-AKT信号转导通路与肿瘤有着广泛而密切的关系,其失衡不仅促进肿瘤的发生于发展,而且可促进肿瘤的侵袭与转移,并参与肿瘤的免疫逃逸。自噬作用在肿瘤的进程中也起着重要的作用。机体大约30%的蛋白质均可发生不同形式的磷酸化,其磷酸化位点主要发生于酪氨酸、丝氨酸与苏氨酸残基,蛋白质磷酸化的异常往往导致细胞生命活动的异常,甚至产生细胞损伤或细胞癌变。P21活化激酶(P21-activated kinase,PAK)为一类保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。可被生长因子及其他细胞外信号活化,并通过众多的下游结合蛋白或激酶底物,调节控制许多生物学功能,在细胞骨架重组、细胞极性调控、细胞迁移、基因转录调控,特别是在细胞的恶性转化和肿瘤细胞侵袭转移中具有重要作用。PAK5作为II类PAK的最新发现且研究最少的成员,与肿瘤的发生发展密切相关。本研究探讨PTBP1对乳腺癌癌细胞生长,迁移及侵袭的作用及机制,探讨PTBP1如何通过PTEN/Akt通路和细胞自噬影响乳腺癌细胞的生长,以及PAK5对PTBP1磷酸化作用,为明确乳腺癌发生发展的分子机制提供依据。方法:1.验证PTBP1在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达:(1)Western blot实验分析PTBP1在乳腺癌细胞系的蛋白表达情况;(2)Western blot实验分析PTBP1在乳腺癌组织的表达;(3)免疫组织化学实验分析PTBP1在乳腺癌组织的表达。2.证实PTBP1在乳腺癌发展中的重要意义:(1)MTT实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响;(2)克隆形成实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响;(3)Transwell实验检测PTBP1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响;(4)裸鼠荷瘤实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响。3.PTBP1促进乳腺癌细胞生长的机制研究:(1)Western blot实验证实PTBP1对PTEN-Akt通路的影响;(2)Western blot实验证实PTBP1对细胞自噬的影响;(3)Western blot实验分析PAK5与PTBP1蛋白表达的相关性。4.PAK5与PTBP1相互作用的验证:(1)TNT结合GST pulldown实验,证实PAK5与PTBP1在体外直接结合;(2)免疫共沉淀实验,证实PAK5与PTBP1的体内相互作用;(3)在乳腺癌细胞中过表达PAK5,Western Blot检测PAK5对PTBP1蛋白表达的影响;(4)体外激酶分析实验检测PAK5对PTBP1的磷酸化影响。结果:1.验证PTBP1在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达:(1)PTBP1在乳腺癌细胞系中呈高表达;(2)PTBP1在乳腺癌组织中呈高表达。2.证实PTBP1在乳腺癌发展中的重要意义:(1)PTBP1能促进乳腺癌细胞生长;(2)PTBP1促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭;(3)PTBP1能促进裸鼠体内乳腺癌细胞的生长。3.PTBP1促进乳腺癌细胞生长的机制研究:(1)PTBP1通过下调PTEN激活p-Akt通路;(2)PTBP1抑制细胞自噬;(3)PTBP1与p-Akt在乳腺癌组织呈强相关性表达。4.PAK5与PTBP1相互作用的验证:(1)PAK5与PTBP1能够在体外直接结合;(2)PAK5与PTBP1能够在体内相互作用;(3)PTBP1是PAK5新的生理性底物;(4)PAK5能下调PTBP1表达。结论:1.PTBP1在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中均高表达。2.PTBP1通过PTEN/Akt和自噬促进乳腺癌细胞生长。3.PTBP1为PAK5新的生理性底物。