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地球上藻类资源丰富并且多样,开发前景巨大。同时藻类分子遗传学不断飞速发展,使人们对藻类的研究更加深入。螺旋藻是一种古老而保守的蓝藻,因其营养成分丰富,并且应用广泛而备受亲睐。利用已经产业化的螺旋藻作为基因工程受体具有许多优点。但螺旋藻的基因工程研究比较缓慢,限制其发展的一个重要因素就是缺乏良好的转化系统。本文以蓝藻中的转座子为转座元件,以抗性基因和荧光标记基因为筛选标记,建立一种新的螺旋藻转化系统并且尝试转化螺旋藻,开发有效的螺旋藻转化平台。
转座子是广泛存在于生物体内可自由移动的一段DNA序列,可以通过切割、整合等过程将自身携带的基因片段转座到其他位置。首先在蓝藻基因组数据库中寻找合适的蓝藻转座子元件,设计引物并进行PCR扩增。分析发现,蓝藻简单插入序列(IS)同细菌简单插入序列结构类似。根据细菌转座子载体结构,将克隆的蓝藻IS序列分别连接到含有egfp标记基因,nptⅡ标记基因质粒的两端,构建人工转座子载体。以螺旋藻为宿主细胞,利用超声转化法将构建的转座子载体转入到螺旋藻中,结果显示含有蓝藻转座元件的载体转化成功。将其在不同品系螺旋藻中进行转化后成功得到转化子,证明该转座子载体在螺旋藻中适用的广谱性。
多细胞丝状体的螺旋藻给纯化子的筛选带来一定困难,本研究将egfp基因连入转座子转化载体,并且转化后能够稳定表达。利用高速分选流式细胞仪(FACS Vantage)技术,结合其他筛选方法,成功获得螺旋藻纯化转化藻株,有效避免了后续螺旋藻野生藻株的污染。这对于筛选丝状体的工程菌株提供了一定的参考。
以recA基因为整合位点的螺旋藻同源重组载体与转座子转化载体相比,两者在转化效率上差别不明显,但同源重组载体更适合线性化后转化,而转座子载体则刚好与之相反。并且在结果上,同源重组载体的转化子表型单一,转座子载体的转化子表型多样。
本研究首次利用蓝藻简单插入序列构建螺旋藻转座子转化载体,利用egfp基因检测转化结果,并在不同品系螺旋藻中转化获得成功,开辟了螺旋藻新的转化手段,改进了螺旋藻转化子的筛选方法,并比较了不同螺旋藻转化载体间的差异,为进一步完善螺旋藻基因工程的研究工作奠定了基础。