肌苷(Inosine)是嘌呤代谢的中间产物，参与核酸合成、能量提供、蛋白质合成等许多重要的细胞代谢过程，在维持细胞的正常生理代谢中发挥着重要作用，可以作为辅酶类药、抗病毒药和食品增鲜剂等，在医药、保健和食品等领域中具有非常广泛的应用价值。目前，肌苷主要通过发酵法生产，菌种为经过传统诱变的枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）和产氨短杆菌（Brevibacteriumammoniagenes）等。由于传统诱变菌株存在遗传背景不清楚、高产机理不明确和积累副效应突变等问题，极大地限制了菌株的进一步改造和优化。近年来，国内外研究者对肌苷生物合成开展了广泛的代谢工程研究，实现了肌苷的积累。但由于核苷类物质的合成在胞内受到严谨而复杂的调控，采用点对点的基因改造方法难以实现肌苷的高效积累。基于此，本论文在对枯草芽胞杆菌代谢网络分析的基础上，结合分析鸟苷高产菌株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TA208的基因组序列，对枯草芽胞杆菌W168的肌苷代谢网络进行改造，通过增强嘌呤合成途径、切断分支代谢途径和阻断肌苷分解代谢途径等，从头构建了一株遗传背景清楚的高产肌苷的基因工程菌;并进一步对能够显著提高肌苷积累量的新靶点—drm基因编码的磷酸戊糖变位酶(Phosphopentomutase，PPM)影响肌苷分解代谢的作用机理进行了初步研究。　　针对枯草芽胞杆菌分支代谢途径—腺苷合成支路，我们敲除了编码腺苷酸琥珀酸合成酶(Adenylosuccinate synthetase，AdSS)的purA基因，所得到的菌株BS125（B.subtilis W168△purA）摇瓶发酵72 h，可积累肌苷0.62±0.16 g/L，同时次黄嘌呤的积累量为4.63±0.22 g/L。结果表明，敲除purA基因对肌苷积累有一定的作用，但由于分解产物次黄嘌呤积累量较高，需要对肌苷的分解途径进行改造。　　针对枯草芽胞杆菌的肌苷分解途径，我们将菌株BS125中两个编码嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase，PNP)的基因pupG和deoD失活，分别构建了单突变株和双重突变株。敲除pupG基因所获得的菌株BS253(BS125△pupG)摇瓶发酵72 h，肌苷积累量由BS125的0.62±0.16 g/L提高到了8.88±1.10g/L，而次黄嘌呤的积累量由BS125的4.63±0.22 g/L下降为1.21±0.12 g/L; deoD基因缺失菌株BS283（BS125△deoD）摇瓶发酵72 h，肌苷积累量为2.21±0.88 g/L，次黄嘌呤的积累量为4.01±0.67 g/L;双重突变株BS277（BS125△pupG△deoD）的肌苷积累量为9.54±1.19 g/L，且在其发酵液中未检测到次黄嘌呤的积累。该结果表明，与敲除deoD基因相比，敲除pupG基因能更加有效地阻断肌苷分解途径，增加肌苷的积累量。我们分析出现该结果的原因是pupG和deoD基因编码的两种嘌呤核苷磷酸化酶所催化分解的底物偏好性存在差异，即pupG编码的PNP主要以肌苷和鸟苷为底物，而deoD编码的PNP主要以腺苷为底物，所以pupG基因编码的PNP在枯草芽胞杆菌的肌苷分解中起主要作用。虽然双重突变株BS277的肌苷产量略高于pupG敲除菌株BS253，pupG和deoD基因的共同敲除可完全阻断肌苷的分解途径，但该菌株生长非常缓慢。鉴于pupG和deoD双重突变株生长缓慢而pupG单突变株仍积累了较高浓度的分解产物次黄嘌呤，因此需要采取新的策略对肌苷的分解途径进行改造。　　为寻找新的肌苷分解代谢途径改造靶点，我们对本实验室前期已完成全基因组测序的鸟苷高产菌株解淀粉芽胞杆菌TA208基因组进行分析，发现其染色体上一个长达1，259kb的大片段(1，057，022～2，316，118)发生倒置，使drm基因启动子区及5端缺失，导致drm编码的磷酸戊糖变位酶(PPM)功能丧失。由于PPM的反应底物核糖-1-磷酸（Ribose-1-phosphate，R-1-P）为核苷的分解产物，我们推测该突变可能与核昔的分解代谢相关。于是我们参考该突变方式，将BS125中的drm基因启动子区及5端删除，所获得的菌株BS136（BS125△Parm）摇瓶发酵72 h，其肌苷积累量增加至14.44±1.12 g/L，且次黄嘌呤积累量降低至0.22±0.07 g/L。为进一步确认肌苷积累量的提高是否仅为drm基因功能缺失所致，我们又在BS125基础上对drm基因进行全基因敲除和无义突变，所获得的菌株BS251（BS125△drm）和BS291（BS125 drm*）摇瓶发酵72 h，其肌苷积累量分别为13.98±0.41 g/L和14.47±0.55 g/L，次黄嘌呤积累量分别为0.26±0.07 g/L和0.21±0.06 g/L。结果表明，drm基因的缺失或无义突变所导致的PPM功能的丧失可有效阻断肌苷的分解，且效果优于缺失上一步由pupG编码的PNP所阻断肌苷分解的作用。　　针对枯草芽胞杆菌的嘌呤合成途径，我们在BS251菌株中用高拷贝质粒过表达解除反馈抑制的嘌呤合成关键酶谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸转酰胺酶(Glutamine phosphoribosylpyrophosphate aminotransferase，PurF)和磷酸核糖焦磷酸合成酶(Pho sphoribosylpyropho sphate synthetase，Prs)，但肌苷积累量并没有提高。为进一步增强嘌呤合成途径流量，我们选择了四个强度不同的启动子(P43、Pveg、Pctc和PgsiB)对受转录阻遏的嘌呤操纵子的启动子区进行了替换。通过qRT-PCR、翻译起始效率预测和摇瓶发酵实验验证，确定Pveg启动子效果最佳，替换为Pveg启动子后获得的菌株BS316(BS251Ppur∷Pveg)摇瓶发酵72 h，肌苷产量达到16.86±0.78 g/L，且次黄嘌呤积累量仅为0.22±0.01 g/L。　　从上述代谢工程改造工作中，我们发现drm基因编码的PPM对于肌苷积累起重要作用。因此，本论文又对其调控肌苷代谢的作用机理进行了初步探讨。首先，我们检测了W168菌株中PPM功能丧失对于菌株肌苷分解能力的影响。结果显示，drm基因无义突变导致PPM功能丧失后，菌株的肌苷分解能力明显下降;然后又分析了drm无义突变菌株中pupG和deoD表达水平的变化情况。结果显示，PPM功能丧失后菌株BS288（W168 drm*）pupG基因的转录和翻译水平上调，而deoD基因的表达水平无明显变化。由于PPM和PNP共用反应底物核糖-1-磷酸(R-1-P)，因此，我们又在体外检测了R-1-P浓度对于PNP催化肌苷分解反应的影响。结果表明，R-1-P浓度升高或降低会促使PNP所催化反应的反应平衡向肌苷合成或分解的方向移动，从而影响肌苷的分解程度。据此，我们推测PPM功能丧失影响肌苷代谢的可能作用机理为:PPM功能丧失导致菌株胞内的R-1-P浓度升高，促进PNP所催化的反应平衡向肌苷合成方向移动;同时R-1-P浓度升高引起pupG基因表达的上调，提高了肌苷的合成速率，最终使肌苷积累量增加且分解产物次黄嘌呤积累量下降。　　本论文以枯草芽胞杆菌模式菌株W168为出发菌株，从头构建获得了一株高产肌苷的基因工程菌，初步阐明了磷酸戊糖变位酶PPM调控肌苷代谢的作用机理，增进了我们对枯草芽胞杆菌肌苷代谢网络的理解，同时为肌苷生产菌株的育种研究工作提供了新的研究思路和实践经验。