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鸡球虫病是严重危害养鸡业生产的重要寄生虫病,目前仍主要依赖各种抗球虫药物防治。近年来,由于球虫抗药性的产生和人们对绿色环保食品的呼唤,人们开始研究其它可持续的防治技术。从长远观点出发,基因工程苗和/或核酸疫苗是最终控制鸡球虫病的必然选择,而鸡球虫保护性抗原基因的筛选是研制基因工程苗及核酸疫苗研究的基础。入侵相关蛋白是目前研究较多的球虫抗原,主要包括子孢子/裂殖子表面蛋白、以及微线、棒状体、折光体等分泌型亚细胞器抗原。Tomley等(2004)分析了来自E.tenella的子孢子和第二代裂殖子的EST序列,得到了潜在的具有GPI锚定结构域的表面抗原的mRNA序列,研究表明只有一种特定的EtSAGs在子孢子上表达,小部分在两个阶段都有表达,而大部分主要在第二代裂殖子上表达。本研究在国内首先进行了鸡柔嫩艾美耳球虫表面抗原SAG2、SAG7基因的克隆与原核表达,以为进一步研究其免疫原性及其它生物学功能奠定基础。(1)根据GenBank已报道(Tomley等,2005)的E. tenella豪顿株表面抗原SAG2、SAG7mRNA基因序列设计特异性引物,用RT-PCR方法克隆了E. tenella杨陵株SAG2、SAG7基因,与豪顿株相比,核甘酸序列的同源性高达99%,推导的氨基酸序列相似性达99%,这说明SAG2、SAG7基因在不同地理株之间有很高的保守性,而他们与宿主细胞之间的相互作用关系以及是否具有一定免疫原性,有待进一步试验证明。同时应用3′-末端快速扩增法(3′-RACE)获得SAG2/SAG7基因的3′-末端非翻译区,测序表明具有真核生物mRNA基因3′-末端序列的特征,证明扩增获得SAG2/SAG7基因的3′-末端序列。(2)扩增了不含N端疏水性信号肽序列SAG2、SAG7基因,并将其克隆至表达载体pET-32a(+)上,转化大肠杆菌BL21菌,经IPTG诱导,实现其在宿主菌BL21(DE3)中表达,诱导4h后表达量最高,重组蛋白占菌体总蛋白的50%。经SDS-PAGE分析融合蛋白大小分别约为47 ku、45ku,与其推测的结果相一致,证明所表达的产物与目的基因所编码的蛋白大小相一致。表达的蛋白为包涵体形式存在于菌体细胞内,通过不断反复摸索获得了最佳复性条件,并结合镍柱层析获得较高浓度纯化的目的蛋白。(3)应用间接免疫荧光法证明SAG2/SAG7确实是出现在裂殖子表面,而且此两种抗原是同时出现在裂殖子表面,这进一步证实裂殖子表面是同时表达众多不同的抗原。