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随着我国养殖业的迅猛发展，蛋白质资源短缺和氮排放造成的污染问题日益严重，因此，提高饲料中氮营养素的利用效率已成为动物营养研究的热点。氮营养素在机体的代谢利用是一个极其复杂的过程，涉及到各个组织器官间的协同作用，其中，肝脏不仅是氮营养素代谢的重要器官，其分泌的胰岛素样生长因子1（IGF-1）对其他组织器官的蛋白质代谢也具有重要的调节作用。但迄今对日粮蛋白水平调控肝脏IGF-1表达和分泌的作用及机制尚不清楚。同时，亮氨酸是血清游离氨基酸中受日粮蛋白水平影响最大的氨基酸之一，亮氨酸在调控肝脏IGF-1表达与分泌中是否发挥关键作用以及其影响机制目前也尚不清楚。为了探究日粮蛋白水平与亮氨酸对肝脏IGF-1表达和分泌的调控机制，本论文开展了以下4个部分的研究。
第一部分日粮蛋白水平对仔猪肝脏IGF-1分泌及相关基因表达的影响
试验一以28日龄断奶三元杂仔猪为对象，比较了不同蛋白水平的日粮（20%CP与14% CP）条件下猪肝脏IGF-1的表达和血清IGF-1水平，并采用高通量测序技术（RNA-seq）比较其基因表达谱。结果表明，20% CP组仔猪血清 IGF-1浓度和肝脏IGF-1 mRNA表达水平均显著高于14%CP组。RNA-seq分析共得出1319个差异表达的转录本，其中667个上调，652个下调。差异表达基因主要在氧化磷酸化、核糖体、间隙连接及PPAR等信号通路中富集。
第二部分高浓度氨基酸组合对肝细胞IGF-1表达及分泌的影响及机制
试验二分别以仔猪原代肝细胞和 HepG2细胞系为模型，采用不同浓度氨基酸组合进行处理。结果表明，随着氨基酸处理浓度的增加，IGF-1的表达也相应增加。研究还发现，高浓度氨基酸组合还促进了PPARγ mRNA和蛋白水平的表达。进一步采用PPARγ的激活剂曲格列酮（Troglitazone）处理HepG2细胞，也能以剂量依赖性方式增加IGF-1基因表达和分泌，而采用PPARγ的阻断剂GW9662则可有效地逆转高浓度氨基酸组合对HepG2细胞IGF-1 mRNA表达的影响。在HepG2细胞中，高浓度氨基酸组合不仅促进了IGF-1和PPARγ的蛋白表达，还促进了mTOR的磷酸化；采用mTOR阻断剂雷帕霉素（Rapamycin）与高浓度氨基酸组合共处理后，可逆转高浓度氨基酸对IGF-1及PPARγ的促进效应。此外，采用免疫共沉淀技术发现：高浓度氨基酸组合显着增加了mTOR和PPARγ的相互作用。上述结果不仅在细胞水平上验证了高浓度氨基酸组合对IGF-1表达与分泌的促进作用，而且揭示了mTOR/PPARγ信号通路在介导高浓度氨基酸组合调控肝细胞IGF-1表达及分泌中起重要作用。
第三部分亮氨酸通过mTOR调控肝细胞IGF-1的表达及分泌
试验三分别以仔猪原代肝细胞和 HepG2为对象，在培养液中添加亮氨酸，同时以精氨酸与丙氨酸为对照，观察其对肝细胞IGF-1表达与分泌的影响。结果表明：10 mM的亮氨酸和精氨酸均显著促进仔猪原代肝细胞IGF-1的蛋白表达，其中亮氨酸的促进效应大于精氨酸；而10 mM的丙氨酸则无此效应。进一步检测发现：亮氨酸能够呈剂量依赖性地提高仔猪原代肝细胞及HepG2细胞中IGF-1及mTOR的蛋白表达；阻断mTOR则能够逆转亮氨酸对IGF-1基因表达的影响。为了在活体水平上验证其效应，试验采用C57BL/6J小鼠，通过腹腔注射亮氨酸，发现其血清IGF-1的浓度及肝脏IGF-1的mRNA表达水平均显著增加，并呈剂量效应。阻断mTOR后，亮氨酸对IGF-1的促进效应也被逆转。上述结果提示：亮氨酸能够通过 mTOR介导，促进肝脏IGF-1的表达与分泌。
第四部分 JAK2与PPARγ在亮氨酸调控肝细胞IGF-1表达及分泌的作用
试验四分别采用仔猪原代肝细胞、HepG2细胞及C57BL/6J小鼠为模型，首先检测了亮氨酸处理肝细胞对JAK2和PPARγ表达的影响。结果发现：亮氨酸可以显著促进JAK2和PPARγ的蛋白表达。阻断JAK2后，亮氨酸对肝细胞mTOR、PPARγ及IGF-1表达的促进作用被逆转。免疫共沉淀结果表明：亮氨酸对mTOR及PPARγ的蛋白间互作无显著影响；但阻断mTOR后，亮氨酸对PPARγ及STAT3蛋白表达的促进作用被逆转；干扰 PPARγ也逆转了亮氨酸对 IGF-1蛋白表达的促进效应。进一步给C57BL/6J小鼠腹腔共注射JAK2阻断剂和亮氨酸后，发现亮氨酸对血清IGF-1的促进效应消失。上述结果提示：亮氨酸可通过JAK2/mTOR/PPARγ信号通路介导IGF-1的表达及分泌。
综上所述，日粮蛋白水平对仔猪肝脏IGF-1的分泌有显著影响，其中20%CP组显著高于14% CP组。在离体试验条件下，高水平的氨基酸组合能促进肝细胞IGF-1的表达与分泌。日粮不同的蛋白水平可通过改变血液亮氨酸的浓度而导致肝脏分泌IGF-1的变化。亮氨酸对肝脏 IGF-1的表达及分泌的调控作用主要通过JAK2/mTOR/PPARγ信号通路介导。上述研究结果不仅深入揭示了日粮蛋白水平和亮氨酸对肝脏IGF-1分泌的调控机制，丰富了对亮氨酸生理功能的新认识，也为合理配制猪的日粮、提高猪的生长效率提供了试验依据。
第一部分日粮蛋白水平对仔猪肝脏IGF-1分泌及相关基因表达的影响
试验一以28日龄断奶三元杂仔猪为对象，比较了不同蛋白水平的日粮（20%CP与14% CP）条件下猪肝脏IGF-1的表达和血清IGF-1水平，并采用高通量测序技术（RNA-seq）比较其基因表达谱。结果表明，20% CP组仔猪血清 IGF-1浓度和肝脏IGF-1 mRNA表达水平均显著高于14%CP组。RNA-seq分析共得出1319个差异表达的转录本，其中667个上调，652个下调。差异表达基因主要在氧化磷酸化、核糖体、间隙连接及PPAR等信号通路中富集。
第二部分高浓度氨基酸组合对肝细胞IGF-1表达及分泌的影响及机制
试验二分别以仔猪原代肝细胞和 HepG2细胞系为模型，采用不同浓度氨基酸组合进行处理。结果表明，随着氨基酸处理浓度的增加，IGF-1的表达也相应增加。研究还发现，高浓度氨基酸组合还促进了PPARγ mRNA和蛋白水平的表达。进一步采用PPARγ的激活剂曲格列酮（Troglitazone）处理HepG2细胞，也能以剂量依赖性方式增加IGF-1基因表达和分泌，而采用PPARγ的阻断剂GW9662则可有效地逆转高浓度氨基酸组合对HepG2细胞IGF-1 mRNA表达的影响。在HepG2细胞中，高浓度氨基酸组合不仅促进了IGF-1和PPARγ的蛋白表达，还促进了mTOR的磷酸化；采用mTOR阻断剂雷帕霉素（Rapamycin）与高浓度氨基酸组合共处理后，可逆转高浓度氨基酸对IGF-1及PPARγ的促进效应。此外，采用免疫共沉淀技术发现：高浓度氨基酸组合显着增加了mTOR和PPARγ的相互作用。上述结果不仅在细胞水平上验证了高浓度氨基酸组合对IGF-1表达与分泌的促进作用，而且揭示了mTOR/PPARγ信号通路在介导高浓度氨基酸组合调控肝细胞IGF-1表达及分泌中起重要作用。
第三部分亮氨酸通过mTOR调控肝细胞IGF-1的表达及分泌
试验三分别以仔猪原代肝细胞和 HepG2为对象，在培养液中添加亮氨酸，同时以精氨酸与丙氨酸为对照，观察其对肝细胞IGF-1表达与分泌的影响。结果表明：10 mM的亮氨酸和精氨酸均显著促进仔猪原代肝细胞IGF-1的蛋白表达，其中亮氨酸的促进效应大于精氨酸；而10 mM的丙氨酸则无此效应。进一步检测发现：亮氨酸能够呈剂量依赖性地提高仔猪原代肝细胞及HepG2细胞中IGF-1及mTOR的蛋白表达；阻断mTOR则能够逆转亮氨酸对IGF-1基因表达的影响。为了在活体水平上验证其效应，试验采用C57BL/6J小鼠，通过腹腔注射亮氨酸，发现其血清IGF-1的浓度及肝脏IGF-1的mRNA表达水平均显著增加，并呈剂量效应。阻断mTOR后，亮氨酸对IGF-1的促进效应也被逆转。上述结果提示：亮氨酸能够通过 mTOR介导，促进肝脏IGF-1的表达与分泌。
第四部分 JAK2与PPARγ在亮氨酸调控肝细胞IGF-1表达及分泌的作用
试验四分别采用仔猪原代肝细胞、HepG2细胞及C57BL/6J小鼠为模型，首先检测了亮氨酸处理肝细胞对JAK2和PPARγ表达的影响。结果发现：亮氨酸可以显著促进JAK2和PPARγ的蛋白表达。阻断JAK2后，亮氨酸对肝细胞mTOR、PPARγ及IGF-1表达的促进作用被逆转。免疫共沉淀结果表明：亮氨酸对mTOR及PPARγ的蛋白间互作无显著影响；但阻断mTOR后，亮氨酸对PPARγ及STAT3蛋白表达的促进作用被逆转；干扰 PPARγ也逆转了亮氨酸对 IGF-1蛋白表达的促进效应。进一步给C57BL/6J小鼠腹腔共注射JAK2阻断剂和亮氨酸后，发现亮氨酸对血清IGF-1的促进效应消失。上述结果提示：亮氨酸可通过JAK2/mTOR/PPARγ信号通路介导IGF-1的表达及分泌。
综上所述，日粮蛋白水平对仔猪肝脏IGF-1的分泌有显著影响，其中20%CP组显著高于14% CP组。在离体试验条件下，高水平的氨基酸组合能促进肝细胞IGF-1的表达与分泌。日粮不同的蛋白水平可通过改变血液亮氨酸的浓度而导致肝脏分泌IGF-1的变化。亮氨酸对肝脏 IGF-1的表达及分泌的调控作用主要通过JAK2/mTOR/PPARγ信号通路介导。上述研究结果不仅深入揭示了日粮蛋白水平和亮氨酸对肝脏IGF-1分泌的调控机制，丰富了对亮氨酸生理功能的新认识，也为合理配制猪的日粮、提高猪的生长效率提供了试验依据。