细菌纤维素（Bacterial cellulose,BC）是由细菌纤维素合成酶（Bacterial cellulose synthase,BCS）催化β-1,4糖苷键连接吡喃型葡萄糖,聚合形成的一种微生物胞外多糖。相比于植物纤维,细菌纤维素不含果胶、木质素、半纤维素等杂多糖,具有高结晶度、高持水性、高机械强度以及良好的生物相容性等优良特性。细菌纤维素早在1992年就被美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）认证为一种安全的食品添加物,常被用作食品悬浮剂、增稠剂、乳化剂。此外,因其具有可再生、可生物降解以及良好的生物相容性等特性,被广泛地应用于医疗、纺织及造纸等行业。驹形杆菌是研究细菌纤维素生物合成的高产模式菌株。然而,对于驹形杆菌的细菌纤维素合成及调控机制知之甚少,且遗传改造进展缓慢,严重阻碍了细菌纤维素的工业化进程。为了加深对细菌纤维素生物合成调控机制的认识,为产细菌纤维素菌株的遗传改造研究提供理论基础,本文以实验室前期诱变获得的高产菌株P5为研究对象,首先对其所产细菌纤维素的性质进行了比较分析。其次,通过比较基因组学分析、比较转录组学分析等技术对其高产机制进行了探究,并通过构建转座子突变文库对细菌纤维素合成调控基因进行了筛选与鉴定。最后,将菌株P5所产细菌纤维素应用于低碳水、高膳食纤维肉丸制品的制备中。主要研究内容和结论如下:1.高产菌株P5所产细菌纤维素的特性分析本文通过动态和静态培养方式,分别获得了高产菌株P5和出发菌株P1所产细菌纤维素。经扫描电子显微镜分析发现,菌株P5所产细菌纤维素纤维丝更纤细且均一,其动态和静态培养获得的细菌纤维素纤维丝的平均直径分别为26.47±5.94 nm和31.08±7.15 nm。经红外光谱扫描发现,菌株P5所产细菌纤维素官能团的组成类型未发生变化,表现为典型的细菌纤维素红外吸收光谱。X-射线衍射和热重分析结果表明,菌株P5所产细菌纤维素结晶度和热稳定性略有下降。此外,菌株P5所产细菌纤维素的杨氏模量略有下降,但其持水性显著提高。2.比较基因组学分析菌株P5细菌纤维素合成的高产机制高产菌株P5的全基因组由一个环状染色体和一个环状质粒组成,全基因组总长度为3.59 Mbp,GC含量为62.66%,共注释到3306个编码基因。全基因组分析结果表明,菌株P5可利用广泛的碳源合成细菌纤维素。此外,该菌株包含4类细菌纤维素合成酶操纵子,且各操纵子之间核苷酸序列的相似性低。通过比较基因组学分析发现,高产菌株P5中存在136个单核苷酸变异（SNPs）,1个多核苷酸变异（MNP）和1个缺失（DEL）。经KEGG代谢通路分析发现,突变基因较为集中地分布于碳水化合物代谢以及能量代谢相关的通路上。分析相关代谢通路的具体突变基因后推测,与三羧酸循环相关的基因sdh B、fum A、ace F和ald B的突变可能影响菌体的能量代谢水平,从而影响细菌纤维素的合成;编码细菌纤维素合成酶Bcs C亚基的bcs CⅡ基因突变可能影响细菌纤维素的分泌,直接导致细菌纤维素产量的变化。gdh和tkt A基因的突变则可能分别影响葡糖酸盐和果糖-6-磷酸的合成,从而影响细菌纤维素合成前体物质UDPG的合成,进而影响细菌纤维素的合成。3.比较转录组学分析菌株P5细菌纤维素合成的高产机制通过比较转录组学分析菌株P5和P1之间的差异表达基因,以进一步分析菌株P5的细菌纤维素合成的高产机制。并根据KEGG数据库对差异表达基因进行功能分类分析,以确定可能引起细菌纤维素产量变化的差异表达基因。结果发现,与出发菌株P1的基因转录水平相比,高产菌株P5的177个基因表达上调和363个基因表达下调。其中,编码细菌纤维素合成酶亚基的bcs BⅠ和bcs CⅠ基因的上调说明菌株P5中细菌纤维素的合成水平上调,直接促进细菌纤维素的合成;与葡糖酸盐合成相关的基因gcd、gdh和gnt K的下调说明菌株P5中副产物葡糖酸盐的合成水平下调,更多的葡萄糖用于细菌纤维素合成前体物质UDPG的合成;编码纤维素酶的基因gene3141的下调说明菌株P5中细菌纤维素的降解水平下降;与可溶性多糖合成相关的ace基因簇以及其调控因子chv I基因的下调,说明菌株P5中可溶性多糖的合成水平下降,UDPG更多地流向细菌纤维素的合成,导致细菌纤维素产量的增加。此外,菌株P5中与能量代谢相关的多个基因的表达水平下调,表明菌株的能量代谢水平下降,后续可通过提高其能量代谢水平进一步提高细菌纤维素产量。4.菌株P5细菌纤维素合成调控相关基因的筛选与鉴定在探究菌株P5细菌纤维素合成的高产机制的基础上,我们接下来通过转座子突变文库来筛选影响细菌纤维素合成的相关基因,为后续菌株P5的定向遗传改造提高细菌纤维素的产量提供理论支持。首先,以驹形杆菌菌株P5为受体菌株,大肠杆菌SMl0λpir/p SCl89为供体菌株,通过接合转移的方式成功构建了含有8000个突变菌株的转座子突变文库,并建立了细菌纤维素产量的高通量筛选方法,用于筛选细菌纤维素合成调控基因突变菌株。通过初筛3415株突变菌株,摇瓶发酵复筛88株突变菌株,获得33株细菌纤维素产量显著变化的菌株。利用热不对称交错PCR（TAIL-PCR）技术扩增突变菌株中转座子插入位点的侧翼序列,经测序比对发现高产突变菌株7-74中插入突变基因为mnt H,编码锰离子转运蛋白;低产突变菌株1-1、1-9、4-52中插入突变基因均为ett A,编码Ett A蛋白调控细胞内蛋白质的合成;低产突变菌株10-95、12-93中插入突变基因均为opr B,编码碳水化合物孔蛋白;低产突变菌株11-133中转座子插入突变质粒上基因p A＿gene0061,编码Tau E/Saf E家族蛋白,负责亚硫酸盐的输出。5.细菌纤维素在低碳水、高膳食纤维肉丸制品中的应用最后,本文将高产菌株P5经不同培养方式获得的细菌纤维素分别添加至鸡肉、鱼肉和牛肉中以制备低碳水、高膳食纤维肉丸,并对其质构进行测定。质构分析结果表明,静态培养获得的细菌纤维素能有效地改善鸡肉丸的硬度、弹性、咀嚼性、回弹力、胶着性和内聚性,具有较好的改良效果。而动态培养获得的细菌纤维素对鱼丸和牛肉丸的硬度、弹性、咀嚼性、回弹力、胶着性和内聚性具有较好的改良效果。上述结果表明,细菌纤维素作为一种膳食纤维能替代6%的淀粉添加至肉丸制品中,在降低肉丸热量的同时提高肉丸中膳食纤维含量,改善产品的质构特性。综上所述,本文以高产菌株P5为研究对象,对其所产细菌纤维素的特性进行了分析。通过比较基因组学分析,初步确定了菌株P5中与细菌纤维素合成相关的突变位点。通过比较转录组学分析,发现菌株P5的能量代谢水平减弱,并确定了与细菌纤维素产量增加相关的差异表达基因。随后,构建了菌株P5的转座子突变文库,进一步筛选鉴定出了9个细菌纤维素合成调控基因。最后,将细菌纤维素应用于低碳水、高膳食纤维肉丸制品的制作。本研究为后续高产菌株的定向遗传改造以进一步提高细菌纤维素产量奠定了理论基础,为细菌纤维素应用于制备低碳水、高膳食纤维肉丸制品提供了参考。