论文部分内容阅读
目的:药物性肝损伤(Drug-induced Liver Injury,DILI)是基于药物的药理学作用产生的最常见不良反应之一,而对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是一种被广泛使用的镇痛解热药物,过量或长期服用APAP易产生DILI。五味子作为治疗APAP致DILI的理想药源,具有疗效显著、毒副作用小等优势,本课题旨在探究五味子对APAP诱导致DILI的保护作用及其作用机制,对深入开发传统中药五味子的临床应用价值具有深远意义。方法:1.以200mg/kg、300mg/kg和400mg/kg三种APAP剂量进行小鼠DILI造模,测定血浆中AST、ALT指标,确定最佳APAP造模剂量。2.以不同剂量的五味子醇提取物进行小鼠给药预保护,并以APAP建立小鼠DILI模型,测定小鼠血浆中AST、ALT和ALP传统生化指标,PNG、GLDH、Arg-1和α-GST肝损伤早期指标,TNF-α、IL-1β和IL-6炎症水平,并测定小鼠肝组织匀浆中MDA、SOD、GSH和GSH-Px氧化应激及脂质过氧化指标。3.采用UPLC-Q-TOF/MS技术鉴定五味子给予大鼠灌胃给药后血浆中五味子的化学成分,分析五味子入血原型产物和代谢产物。4.以五味子入血成分为基础,结合TCMSP和Swiss Target Prediction数据库筛选获取五味子活性成分作用靶点,利用OMIN和Gene Cards等数据库,以DILI为关键词筛选五味子治疗DILI的潜在靶点,应用DAVID数据库获取靶点和作用通路的相关信息。5.基于UPLC-Q-TOF/MS代谢组学技术,从内源性代谢变化的角度初步探讨五味子醇提取物对小鼠DILI的保护作用机制,运用PCA和OPLS-DA分析方法,根据VIP值和P值筛选差异代谢物,并采用HMDB等数据库进行代谢物鉴定,最终确定五味子治疗APAP诱导致DILI的生物标志物。6.以代谢组学与网络药理学筛选出的作用靶点为研究对象,进行Real-time PCR验证,推测五味子治疗APAP诱导致DILI的作用通路及机制。结果:1.给予200 mg/kg、300 mg/kg和400 mg/kg剂量APAP均能成功建立DILI模型,AST和ALT的水平与空白组小鼠相比皆呈极显著上升趋势(P<0.01)。2.五味子给药预保护组能显著降低AST、ALT、TNF-α、IL-1β、PNP、MDA水平,能显著升高SOD、GSH水平,改善APAP诱导引起的肝损伤。3.采用UPLC-Q-TOF/MS技术,共识别鉴定出戈米辛T、戈米辛J、五味子醇甲、戈米辛D、五味子醇乙、五味子酯乙、当归酰戈米辛Q、五味子甲素和五味子乙素9个入血原型产物和10个代谢产物。4.五味子的9个入血成分和10个代谢成分主要作用于SRC、EGFR、TNF和PTGS2等16个关键靶点,通过凋亡调控、调节细胞死亡和蛋白质氨基酸磷酸化等生物进程调控五味子治疗DILI,共富集到Pathways in cancer、VEGF、Bladder cancer、Erb B signaling pathway和Gn RH signaling pathway及其相互作用等15条信号通路。5.基于UPLC-Q-TOF/MS的代谢组学技术,共鉴定出32种与肝损伤过程相关的代谢物质,这些代谢物共富集在视黄醇代谢通路、花生四烯酸代谢通路、甘油磷脂代谢通路、卟啉与叶绿素代谢通路和氨基酸代谢通路等13条代谢通路上。6.结合代谢组学与网络药理学筛选的作用靶点,共确定PTGS2、SRC、TNF、PLA2G4A和EGFR在内的35个作用靶点,并最终确定23个靶点基因进行PCR验证。结论:1.在对五味子治疗APAP诱导致DILI的药效学研究中发现以200mg/kg APAP剂量造模最适宜,且五味子对APAP诱导致DILI具有明显的保护作用,主要通过降低血浆中的肝酶指标,对抗氧化应激、脂质过氧化以及减轻炎症反应来发挥APAP诱导小鼠所致的DILI。2.通过UPLC-Q-TOF/MS技术共鉴定出五味子9个入血原型产物和10个代谢产物,推测这两种类型的成分可能是五味子产生药效并起到预防或治疗疾病作用的体内效应成分。3.通过网络药理学初步验证了五味子治疗DILI药理作用的分子机制,为进一步深入研究其作用机制提供了理论基础,同时也充分表明了五味子具有“多成分-多靶点-多通路”的作用特点。4.通过代谢组学技术进一步验证了五味子对APAP诱导的DILI具有保护作用,并初步探讨了五味子对DILI的保肝功效可能与视黄醇代谢、花生四烯酸代谢和甘油磷脂代谢等相关代谢通路有关。5.结合代谢组学技术和PCR验证,五味子对APAP致DILI主要通过EGFR/TNF/NFk B通路、EGFR/MDM2/p53通路、EGFR/AA通路、Keap1-NRF2/ARE/HO-1-NQO1通路、PLD1/p21通路和LPCAT1/PI3K/AKT等相关代谢通路发挥治疗及保护作用,为开展治疗APAP致DILI创新中药研发奠定基础。