背景和目的：　　原发性肝癌是世界范围内最常见恶性肿瘤之一，其中，肝细胞性肝癌(Hepatocellular Carcinomas，HCCs，简称肝癌)是最常见的原发性肝恶性肿瘤的类型之一，它在男性恶性肿瘤中死亡率中位居第二位。我国是乙肝高发区之一，肝癌患者占世界一半以上。但是，由于HCC早期在临床上无特征性表现，就诊时往往已是中晚期。肝癌最有效的治疗手段是根治性切除，但是目前根治性切除率较低，这是肝癌预后差的主要原因之一。因此，肝癌的早期预警和早期干预有着重要的意义，进一步深入研究肝癌早期发生的分子机制以及早期诊断的改进显得尤为重要。　　其中，肿瘤早期发生很可能受到ceRNA的调控。“ceRNA假说”于2011年被提出后，研究人员从生物信息学、细胞生物学和动物模型等不同水平验证了该假说。ceRNA分子，比如mRNA，lncRNA、假基因等，被认为能够通过microRNA(miRNA)应答元件(MicroRNA Response Element，MRE)竞争结合相同的miRNA来行使调节各自表达水平的作用。基因转录后调控得到了ceRNA假说的补充，在肿瘤等疾病发生发展中提供了转录组研究的新思路。环状RNA是ceRNA家族新成员，不同于线性RNA，环状RNA没有5末端帽子结构和3末端多聚腺苷酸(poly A)尾巴结构，而是以共价键形成首尾相连的闭合环形结构，天然并于广泛存在于不同种族的真核细胞系中。最近，一些circRNA已被证明含有多个保守的miRNA结合位点，可以调控基因的表达，肿瘤的发生和发展过程受到这些表观遗传学上的改变的调控。所以，深入研究HCC发生发展过程中重要信号通路以及节点分子的表达谱，将极大地促进HCC早期诊断及治疗手段的发展，具有较高的科研价值。　　近年来大量非编码RNA，特别是miRNA和长链非编码RNA(Long non-codingRNA，lncRNA)，在肝癌生物学功能调控以及肝癌临床诊断中的潜在应用受到了越来越多的关注。近年来环状RNA的发现与进一步认知，丰富了转录后翻译水平调控家族。越来越多互相作用、互相影响并且在幕后控制分子修饰与表达的环状RNA分子参与了转录后翻译水平的调控。目前，研究已发现并证实circRNA参与多种肿瘤细胞生物学功能的调节，包括结直肠癌、食管鳞状细胞癌、胃癌、乳腺癌和基底细胞癌等等。环状RNA表达失调与多种恶性肿瘤相关，在不同肿瘤类型中，环状RNA可能起到抑癌基因或是癌基因的作用。但是，目前环状RNA参与调控肝癌早期发生及分子机理方面的报道甚少，肝癌早期相关环状RNA表达谱仍需要深入的研究。　　在本研究中，利用环状RNA芯片，我们对比了10对极早期（BCLC0期）肝癌与配对癌旁新鲜组织环状RNA表达谱，并通过大样本定量检测从早期肝癌样本中筛选与早期肝癌发生相关的环状RNA，建立肝癌早期发生表型相关特征环状RNA谱，最终选取肝癌组织比癌旁组织升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA，探讨其作为早期肝癌发生独立预警分子和治疗靶点的应用价值。　　基于以上背景，我们系统研究了环状RNA Circ-0008285这一与HCC早期发生相关的特异性环状RNA在肝癌起始过程中的作用，发现其可以通过竞争性结合miR-892a上调肝癌细胞中miR-892a的靶基因HDGF表达，从而促进HCC的发生，为预测HCC提供了新思路、新方法和早期肝癌潜在治疗靶点。　　方法：　　1.通过生物芯片筛选，建立肝细胞癌差异表达circRNA谱，确定重点研究circRNA，利用RT-PCR的方法，结合临床大样本筛选鉴定并规模验证肝癌早期发生相关差异circRNA;　　2.选取肝癌比癌旁升高表达最显著的环状RNA Circ-0008285作为候补circRNA，进行后续功能验证;　　3.设计反向扩增PCR引物，产物扩增回收后结合一代测序技术明确Circ-0008285成环形式及成环序列的具体核酸信息，确认其来源母基因;　　4.荧光定量PCR检测现有10种肝癌细胞系（SMMU7721、Huh7、HepG2、HCCLM3、PLC/ARF5、97H、97L等），2种相对正常肝细胞系（L02和QSG7701）和2种免疫细胞系（THP-1和U-937）中Circ-0008285的表达水平，分别确定两株高低表达Circ-0008285的肝癌细胞系用于功能分析;　　5.通过慢病毒表达系统构建环状RNA Circ-0008285的干扰和过表达细胞系，并检测干扰和过表达的效果;　　6.通过细胞核质分离实验，确认环状RNA Circ-0008285在细胞中的定位，并根据其具体定位进行相应的功能学实验;　　7.分别对Circ-0008285高表达细胞系使用干扰慢病毒、对Circ-0008285低表达细胞系使用过表达慢病毒，观察干预Circ-0008285后细胞干性、增殖表型的变化;　　8.使用上述干预手段预处理干扰Circ-0008285细胞系，通过体外以及体内有限稀释实验，研究Circ-0008285对肿瘤发生过程的影响;　　9.通过RT-PCR及Western Blot技术检测干扰和过表达环状RNA Circ-0008285后对其母基因线性转录本表达是否具有影响;　　10.结合生物信息学分析可能与Circ-0008285相互作用的miRNA，使用RNA Pulldown实验确定预测的miRNA是否与Circ-0008285发生相互作用;　　11.利用建立的环状RNA Circ-0008285稳定干扰肝癌细胞系(HC CLM3)进行mRNA芯片分析筛选，以期验证在肝癌细胞中哪些理论上的miRNA靶基因的表达受到Circ-0008285的调控;　　12.使用荧光定量PCR、Western Blot和目的基因3非翻译区报告双荧光素基因质粒确定Circ-0008285调控关键节点基因的主要方式;　　13.通过生物信息学分析的与Circ-0008285相互作用的miRNA潜在靶基因中寻找可能调节关键信号通路活性的分子，干扰或过表达后通过干性表型分析确认Circ-0008285是否通过竞争性吸附miRNA、恢复相应基因表达水平、调节细胞增殖、干性表型;　　14.通过Western Blot实验技术研究Circ-0008285引起的信号通路分子活性改变，确认这些信号通路是否参与Circ-0008285调控的肝癌早期发生过程;　　结果：　　1.完成10对极早期肝癌与配对癌旁新鲜组织circRNA异常表达分析，选取癌比癌旁升高表达最显著的Circ-0008285作为目标研究对象。　　2.大样本验证Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中表达情况，发现Circ-0008285在极早期和早期肝癌组织中普遍比相对应的癌旁组织中表达升高。　　3.Circ-0008285在肝癌细胞系中普遍表达较高，并主要分布于细胞质中，可以竞争性结合miR-892a，行使miRNA海绵的作用，影响其下游基因HDGF的表达。　　4.Circ-0008285可以促进细胞的自我更新和增殖。　　5.Circ-0008285在体内及体外均能够促进肝癌细胞的干性表型和肿瘤生长。　　6.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达，增强其与膜受体NCL相互作用，激活PI3K/AKT/mTOR信号通路。　　7.Circ-0008285可升高肝癌细胞中HDGF的表达，增强其与膜受体NCL相互作用，激活PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin通路，促进β-catenin的核转位。　　结论：　　本研究通过不同临床分期的肝癌及配对癌旁样本和不同的肝癌细胞系的表达验证实验，证实在早期肝癌中环状RNA Circ-0008285的表达异常升高。环状RNACirc-0008285可以作为miRNA海绵竞争性地结合miR-892a，促进miR-892a下游靶基因HDGF的表达升高。HDGF作为分泌性肝癌相关癌蛋白与其受体NCL结合后进入胞内，激活PI3K/AKT/mTOR通路以及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路，提高了EPCAM+的肝肿瘤起始细胞比例，并促进了肝癌细胞的自我更新和增殖，最终促使了肝癌的发生。这些是Circ-0008285实现对肝癌发生的重要调节机制。综上所述，本研究结果提示环状RNACirc-0008285是HCC早期诊断以及治疗的潜在干预靶点。