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枸杞子作为药食两用的原料，是茄科植物宁夏枸杞的干燥、成熟果实，其性平、味甘，具有滋补肝肾、益精明目的作用，可用于虚劳精亏、腰膝酸痛、眩晕耳鸣、内热消渴、血虚萎黄、目昏不明等症状，具有很高的食用价值。枸杞子中还含有黄酮类化合物，其中的芦丁具有抗自由基活性、降低毛细血管通透性、抗炎等多方面的药理活性。枸杞子作为药食两用品种，民间常将其加工成各种食品、饮料、保健酒、保健品等，而人们平常多用普通白酒进行浸泡后饮用。
本文以从市场购买的枸杞果实为实验材料，考察提取芦丁时不同浓度乙醇和不同超声时间对其含量的影响。同时以其水解产物槲皮素为指标，考察芦丁在不同酸浓度下的水解程度。
一、相关材料和仪器
1.实验材料。实验原料：枸杞子，采购于市场（生产企业：某药业有限公司）。
实验试剂：芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，HPLC含测：91.9%）;槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，HPLC含测：97.4%）;无水乙醇（分析纯）;盐酸;硫酸;甲醇（色谱纯）;超纯水。
2.实验仪器。AgiLent1260高效液相色谱仪;电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）;恒温水浴锅（上海荣丰科学仪器有限公司）;超声波清洗机（洁康PS-G60A）。
二、实验方法
1.色谱条件。色谱柱：DiamonsiL C18（5μm，200mm×4.6mm，8025364）;流动相：甲醇∶0.2%磷酸（45∶55）;流速：1.0mL/min;检测波长：360nm;柱温：30℃;进样量均为10μL。
2.对照品溶液制备。取芦丁对照品和槲皮素对照适量，精密称定，加50%乙醇制成每1mL含芦丁40μg、槲皮素40μg。
3.标准曲线绘制。精密量取1μg/mL的芦丁对照品贮备液1、2、4、8mL置于10mL容量瓶中，50%乙醇定容，制成4、8、16、32、40μg/mL的芦丁对照品溶液和槲皮素对照品溶液。色谱分析时，对照品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。各吸取10μL进样，按上述色谱条件进行色谱分析。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得芦丁回归方程Y=536.5X-357.8，R=0.9994，表明芦丁在4-40μg/mL范围内线性良好。
4.样品溶液制备。（1）芦丁在不同乙醇浓度的制备方法。枸杞子60g烘干，粉碎，过3号筛，取约5g，精密称定，置三角烧瓶中，分别精密加40%、50%、55%、60%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，再分别用相应浓度乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液B。
（2）芦丁在不同的超声时间的制备方法。取上述粉末，分别精密加入55%乙醇50mL，密塞，称定重量，分别超声30min、40min、50min、60min，放冷，再称定重量，再分别用相应浓度乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液A。
（3）槲皮素的制备方法。精密称取上述粉末约5g，置三角烧瓶中，芦丁提取条件根据最优条件（55%乙醇、超声30min）进行制备。精密量取25mL，蒸至近干，分别加入1%硫酸、3%硫酸、5%硫酸、7%硫酸25mL，密塞，称定重量，加热回流2h，放冷，用相应浓度硫酸补足减失的重量。用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯提取液蒸干，残渣加50%乙醇溶解，转移至5mL量瓶中，加55%乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液C。
5.精密度试验。取对照品溶液，重复进样6次，每次进样10μL，记录峰面积。结果显示，芦丁峰面积的RSD为0.8%，表明精密度良好。
6.重复性试验。取枸杞子细粉，平行制备6份供试品溶液，分别测定，结果芦丁含量的平均值（n=6）为1.81%，RSD为1.3%;槲皮素含量的平均值（n=6）为1.56%，RSD为0.9%，表明重复性良好。
7.稳定性试验。取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12h进样10μL，结果芦丁峰面积的RSD为1.1%，槲皮素峰面积的RSD为1.0%，表明供試品溶液在12h内稳定性良好。
8.回收率实验。精密称取已知含量的样品，加芦丁对照品适量，按供试品溶液的制备方法操作，按上述色谱条件进行色谱分析，测定平均回收率为99.1%，RSD为1.32%。
三、结果与分析
1.色谱条件优化。（1）检测波长的选择。取对照品溶液，比较在256、286、320、342、360nm的HPLC图谱，发现360nm处色谱峰分离情况良好，各组分均有较大吸收，故选定360nm为色谱分析的检测波长。
（2）流动相及洗脱方式的选择。以甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸体系为流动相进行等度洗脱试验，结果表明以甲醇-0.2%磷酸（45∶55），分离效果较好。
2.芦丁提取条件优化。精密吸取供试品溶液A、B、C各10μL，注入液相色谱仪，测定不同乙醇浓度、超声时间下芦丁的提取结果，试验结果见表1、表2。结果表明：随乙醇浓度的增加，测得芦丁含量呈上升趋势，在乙醇浓度为60%时趋于平稳，故选乙醇浓度55%为宜。而随超声时间不断延长，测得芦丁含量呈上升趋势，超声时间60min时趋于平稳，故选择超声60min为宜。
3.槲皮素酸水解条件优化。由表3可知，随着硫酸浓度的增加，芦丁水解效果明显，在硫酸为5%时水解产物槲皮素达到最大值。硫酸浓度为7%时，芦丁水解基本完成，槲皮素的含量急剧减少，说明在这个浓度下槲皮素也开始进行水解。所以，芦丁水解成槲皮素的最优条件是硫酸浓度为5%。
四、讨论
经过试验，枸杞子中芦丁的最优提取条件为乙醇浓度55%、超声时间60min;芦丁水解成槲皮素最优条件为5%硫酸。试验过程中同时使用盐酸对芦丁进行水解，槲皮素未检测出，试验结果不显著。本方法对枸杞子的提取条件进行了一定的摸索，为后续评价和控制枸杞子的质量提供了方法，并对其食用价值提供了依据。
作者简介：曹虎灵（1986-），男，贵州龙里人，硕士研究生，工程师，研究方向为食品药品检验。
薛朝金（1975-），贵州毕节人，大学本科，副主任药师，研究方向为药品质量标准。
本文以从市场购买的枸杞果实为实验材料，考察提取芦丁时不同浓度乙醇和不同超声时间对其含量的影响。同时以其水解产物槲皮素为指标，考察芦丁在不同酸浓度下的水解程度。
一、相关材料和仪器
1.实验材料。实验原料：枸杞子，采购于市场（生产企业：某药业有限公司）。
实验试剂：芦丁对照品（中国食品药品检定研究院，HPLC含测：91.9%）;槲皮素对照品（中国食品药品检定研究院，HPLC含测：97.4%）;无水乙醇（分析纯）;盐酸;硫酸;甲醇（色谱纯）;超纯水。
2.实验仪器。AgiLent1260高效液相色谱仪;电子分析天平（德国赛多利斯股份公司）;恒温水浴锅（上海荣丰科学仪器有限公司）;超声波清洗机（洁康PS-G60A）。
二、实验方法
1.色谱条件。色谱柱：DiamonsiL C18（5μm，200mm×4.6mm，8025364）;流动相：甲醇∶0.2%磷酸（45∶55）;流速：1.0mL/min;检测波长：360nm;柱温：30℃;进样量均为10μL。
2.对照品溶液制备。取芦丁对照品和槲皮素对照适量，精密称定，加50%乙醇制成每1mL含芦丁40μg、槲皮素40μg。
3.标准曲线绘制。精密量取1μg/mL的芦丁对照品贮备液1、2、4、8mL置于10mL容量瓶中，50%乙醇定容，制成4、8、16、32、40μg/mL的芦丁对照品溶液和槲皮素对照品溶液。色谱分析时，对照品溶液过0.45μm有机系微孔滤膜。各吸取10μL进样，按上述色谱条件进行色谱分析。以质量浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线并进行回归计算，得芦丁回归方程Y=536.5X-357.8，R=0.9994，表明芦丁在4-40μg/mL范围内线性良好。
4.样品溶液制备。（1）芦丁在不同乙醇浓度的制备方法。枸杞子60g烘干，粉碎，过3号筛，取约5g，精密称定，置三角烧瓶中，分别精密加40%、50%、55%、60%乙醇50mL，密塞，称定重量，超声30min，放冷，再称定重量，再分别用相应浓度乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液B。
（2）芦丁在不同的超声时间的制备方法。取上述粉末，分别精密加入55%乙醇50mL，密塞，称定重量，分别超声30min、40min、50min、60min，放冷，再称定重量，再分别用相应浓度乙醇补足减失的重量，摇匀，取续滤液，作为供试品溶液A。
（3）槲皮素的制备方法。精密称取上述粉末约5g，置三角烧瓶中，芦丁提取条件根据最优条件（55%乙醇、超声30min）进行制备。精密量取25mL，蒸至近干，分别加入1%硫酸、3%硫酸、5%硫酸、7%硫酸25mL，密塞，称定重量，加热回流2h，放冷，用相应浓度硫酸补足减失的重量。用乙酸乙酯振摇提取3次，每次20mL，合并乙酸乙酯提取液蒸干，残渣加50%乙醇溶解，转移至5mL量瓶中，加55%乙醇至刻度，摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液C。
5.精密度试验。取对照品溶液，重复进样6次，每次进样10μL，记录峰面积。结果显示，芦丁峰面积的RSD为0.8%，表明精密度良好。
6.重复性试验。取枸杞子细粉，平行制备6份供试品溶液，分别测定，结果芦丁含量的平均值（n=6）为1.81%，RSD为1.3%;槲皮素含量的平均值（n=6）为1.56%，RSD为0.9%，表明重复性良好。
7.稳定性试验。取同一供试品溶液，室温下放置，分别于0、2、4、6、8、12h进样10μL，结果芦丁峰面积的RSD为1.1%，槲皮素峰面积的RSD为1.0%，表明供試品溶液在12h内稳定性良好。
8.回收率实验。精密称取已知含量的样品，加芦丁对照品适量，按供试品溶液的制备方法操作，按上述色谱条件进行色谱分析，测定平均回收率为99.1%，RSD为1.32%。
三、结果与分析
1.色谱条件优化。（1）检测波长的选择。取对照品溶液，比较在256、286、320、342、360nm的HPLC图谱，发现360nm处色谱峰分离情况良好，各组分均有较大吸收，故选定360nm为色谱分析的检测波长。
（2）流动相及洗脱方式的选择。以甲醇-0.2%磷酸、乙腈-0.2%磷酸体系为流动相进行等度洗脱试验，结果表明以甲醇-0.2%磷酸（45∶55），分离效果较好。
2.芦丁提取条件优化。精密吸取供试品溶液A、B、C各10μL，注入液相色谱仪，测定不同乙醇浓度、超声时间下芦丁的提取结果，试验结果见表1、表2。结果表明：随乙醇浓度的增加，测得芦丁含量呈上升趋势，在乙醇浓度为60%时趋于平稳，故选乙醇浓度55%为宜。而随超声时间不断延长，测得芦丁含量呈上升趋势，超声时间60min时趋于平稳，故选择超声60min为宜。
3.槲皮素酸水解条件优化。由表3可知，随着硫酸浓度的增加，芦丁水解效果明显，在硫酸为5%时水解产物槲皮素达到最大值。硫酸浓度为7%时，芦丁水解基本完成，槲皮素的含量急剧减少，说明在这个浓度下槲皮素也开始进行水解。所以，芦丁水解成槲皮素的最优条件是硫酸浓度为5%。
四、讨论
经过试验，枸杞子中芦丁的最优提取条件为乙醇浓度55%、超声时间60min;芦丁水解成槲皮素最优条件为5%硫酸。试验过程中同时使用盐酸对芦丁进行水解，槲皮素未检测出，试验结果不显著。本方法对枸杞子的提取条件进行了一定的摸索，为后续评价和控制枸杞子的质量提供了方法，并对其食用价值提供了依据。
作者简介：曹虎灵（1986-），男，贵州龙里人，硕士研究生，工程师，研究方向为食品药品检验。
薛朝金（1975-），贵州毕节人，大学本科，副主任药师，研究方向为药品质量标准。