【摘 要】
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目的 研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品.方法 通过检索美国国家生物技术信息中心基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaTEM、blapsE、 blaCTX-M、blaCMY和blaOXA的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌.将工程菌传代培养15代,同时使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性.大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品.使用PCR和定量逆转录PCR (q
【机 构】
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西北农林科技大学食品科学与工程学院,杨凌712100;中国检验检疫科学研究院,北京100176;河北省食品检验研究院,石家庄050000;中国食品药品检定研究院,北京 100050
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目的 研制可作为β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测质控用标准样品.方法 通过检索美国国家生物技术信息中心基因库,获得β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因blaTEM、blapsE、 blaCTX-M、blaCMY和blaOXA的DNA序列,构建耐药基因重组质粒和工程菌.将工程菌传代培养15代,同时使用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增和DNA测序测定确认目标基因的遗传稳定性.大量制备菌悬液,提取重组质粒,真空干燥得到质粒标准样品.使用PCR和定量逆转录PCR (quantitative reverse transcription PCR,RT-qPCR)检测质粒标准样品的最低检出限.使用超微量分光光度计测定质粒标准样品的质量,RT-qPCR测定质粒作为模板扩增时的循环数(cycle threshold,Ct),以此评价标准样品的均匀性及贮藏稳定性.结果 5种重组质粒DNA可在工程菌中稳定遗传且无突变发生,5种质粒DNA标准样品均匀性良好.各质粒DNA经梯度稀释后,PCR最低检出限在2.33× 104～2.25× 106拷贝数/μL之间,RT-qPCR最低检出限在1.93～1850拷贝数/μL之间.样品在37 ℃贮存14 d、4 ℃贮存3个月、-20 ℃贮存12个月稳定性良好.结论 研究制备得到的β-内酰胺类抗生素耐药编码基因检测用质粒标准样品的目的 基因遗传稳定性、标准样品的均匀性和贮存稳定性均良好.
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