【摘 要】
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TIL具有抗肿瘤的活性,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用.本实验拟扩增GrB全序列,构建GrB的原核表达载体,从而建立其原核表达体系,获得高效表达的重组GrB,
【机 构】
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中山大学中山医学院生物化学教研室,广州,510080广州医学院化学致癌研究所,广州,510182;中山大学中山医学院肿瘤防治中心头颈外科,广州,510080;
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TIL具有抗肿瘤的活性,其中颗粒酶B在杀伤肿瘤细胞的过程中起了最重要的作用.本实验拟扩增GrB全序列,构建GrB的原核表达载体,从而建立其原核表达体系,获得高效表达的重组GrB,纯化蛋白.用淋巴细胞分离液分离肿瘤组织中的淋巴细胞,并抽提RNA,RT-PCR方法获得GrB的全长,并重组到pGEX-4T-1中,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定,IPTG诱导pGEX-GrB转化的BL21菌,大量纯化表达产物,并通过SDS-PAGE、Western blot分析表达产物,用MTT法体外检测GrB对Hep2细胞的作用.结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得GrB基因片段,GrB准确克隆入pGEX-4T-1,成功的构建pGEX-GrB,经诱导表达出与GST融合的蛋白,经凝血酶酶切后获得与GrB相符的条带,并能与GrB特异性抗体结合.体外实验表明,GrB能抑制Hep2细胞的增殖.成功构建了pGEX-GrB,并成功表达、大量纯化GrB蛋白,其能够抑制Hep2细胞的增殖.
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