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摘 要：目的：建立头孢托仑匹酯中苯残留的气相色谱检测方法 方法：顶空毛细管气相色谱法，FID检测器，HP-5毛细管柱，分流进样，顶空加热温度70℃。结果：检测限0.05ppm，精密度及线性关系良好，平均回收率95.9%。结论：本方法准确、灵敏度高，可用于头孢妥仑匹酯中苯残留检测。
关键词：头孢托仑匹酯;苯残留;气相色谱法
一、前言
头孢托仑匹酯是第四代口服头孢菌素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广泛而强大的抗菌作用，临床疗效确切，安全稳定，口服吸收好、体内分布广、血药浓度高等特点，应用广泛。
头孢妥仑匹酯的常规溶剂二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲苯、DMF的检测方法已经收录在药典或已有报道，而工艺中间接引入的溶剂杂质的研究报道较少。从用药安全性角度，原料中引入的杂质，特别是毒性较大的杂质也是必须有相应的检测方法来检测控制。头孢托仑匹酯中用到的常规溶剂丙酮、甲苯的生产工艺中用到苯，苯在中国药典和《残留溶剂指导原则》（ICH Q3C）中被定义为一类溶剂，规定其限度为2ppm。痕量溶剂残留的检测方法已有报道中多为质谱法、热解吸/化学发光联用技术、双光子电离技术，操作复杂、且依赖昂贵仪器。目前尚未见头孢托仑匹酯中苯残留检测方法的报道。本文参考中国药典通则0861残留溶剂检查法和相关文献，建立了顶空气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中基因毒性杂质苯残留量的方法，该方法仪器通用易得、简便、准确、灵敏。
二、仪器与试药
Agilent 7890B气相色谱仪（美国安捷仑公司）;
十万分之一分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）
头孢托仑匹酯（齐鲁制药有限公司提供，批号20190606）
N，N-二甲基甲酰胺（DMF，Merk公司，色谱纯）
苯（国药集团化使有限公司，色谱纯）
三、方法与结果
1.色谱条件
色谱柱：HP-5，30m*0.53mm*5.0μm;检测器：FID;载气：氮气;载气流速：6.5mL/min;柱温：50℃保持10分钟，然后以30℃/min的速率升温至180℃;进样口温度：150℃;检测器温度：250℃;顶空炉温度：70℃;平衡时间：30min;进样量1ml
2.溶液配制
对照溶液：精密量取5.7μl苯于盛有适量DMF的50ml容量瓶中，用DMF稀释并定容混匀，为对照品储备液。精密量取上述溶液0.5ml于盛有适量DMF的50ml容量瓶中，用DMF稀释并定容混匀，为对照溶液。
供试品溶液：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加DMF使其溶解并稀释定容混匀，为供试品溶液。
系统适用性溶液：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加对照溶液使其溶解并稀释定容混匀，为供试品与对照品混合溶液。
3.专属性考察
取空白溶剂DMF、对照溶液、供试品溶液、系统适用性溶液分别进样，记录色谱图。结果表明，空白对测定无干扰，各组分分离度9.13（>1.5），被测组分峰理论塔板数5320（>5000），对称因子1.09（在0.75～1.5范围内）。供试品中其它组分对测定结果无影响，方法专属性好。
4.检测限和定量限的测定
取对照溶液，逐步稀释，用信噪比法计算检测限LOD、定量限LOQ。使苯的信噪比（S/N）为3時，即为苯的检测限，浓度为0.025μg/ml，换算样品浓度后为0.05ppm;使苯的信噪比（S/N）为10时，即为苯的定量限，浓度为0.12μg/ml，换算样品浓度后为0.2ppm。
5.线性与范围
精密量取对照品贮备溶液0.1、0.4、0.8、1.0、1.5ml，分别置于100ml容量瓶中，加DMF稀释定容，配置成10%、40%、80%、100%、150%限度溶度的溶液，进样记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=1.4893X+1.1568，相关系数r=0.9995，表明峰面积与浓度线性关系良好。
6.准确度（回收率）试验
精密量取对照品贮备溶液0.8、1.0、1.2ml，分别置于100ml容量瓶中，约相当于限度的80%、100%、120%，加入已测定苯残留量的供试品（批号：20190606，未检出）约5000mg，用DMF溶解并稀释定容，摇匀，作为回收率测试溶液，每个浓度配置3份，进样记录色谱图，计算苯的量、回收率、平均回收率和RSD，结果80%、100%、120%浓度水平的回收率分别为95.6%、99.2%、92.9%。表明苯的回收率都在80%～120%之间，平均回收率95.9%，RSD2.23%，符合要求。
7.精密度（重复性）试验
取对照溶液，进样记录图谱，平行操作6次，结果苯的峰面积的RSD为4.13%，表明该方法精密度良好。
8.耐用性考察
在其它条件不变的情况下，考察了进样口温度（150℃±3℃）、流速（6.5ml/min±0.3ml/min）、柱温（50℃±3℃）、顶空炉温（70±3℃）、顶空平衡时间（30min±5min）及不同批号色谱柱，测试结果的变化，结果表明，在以上条件变化范围内，获得的色谱图苯与前后峰的分离度均≥1.5。
四、结论
通过以上实验，本方法准确灵敏耐用性好，可用于头孢托仑匹酯中苯残留检测。具体方法如下：采用HP-530m*0.53mm*5.0μm色谱柱、FID检测器，载气为氮气，流速：6.5mL/min，柱温为50℃保持10分钟，然后以30℃/min的速率升温至180℃，进样口温度150℃，检测器温度250℃，顶空炉温度70℃平衡30min，分流进样量1ml。测定法：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加DMF使其溶解并稀释定容混匀，为供试品溶液。精密量取苯对照品储备液0.5ml，稀释至50ml为对照溶液。顶空进样记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。 参考文献
[1] 陈忆铃，冯芳.气质联用技术在基因毒性杂质检测中的应用进展[J].广州化工，2020，48（05）：21-23+81.
[2] 汪生，杭太俊.药物中基因毒性杂质检测策略的研究[J].中国新药杂志，2019，28（23）：2840-2846.
[3] 王晨，李东伟，崔晨辉，王晶，王彦广.气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中N，N-二甲基甲酰胺残留量[J].中国抗生素杂志，2019，44（10）：1163-1166.
[4] 刘春玲，刘春菊，刘希，陈玉洁，李志怀，隰艳华.UPLC-MS/MS法检测雷迪帕韦原料药中潜在基因毒性杂质残留量[J].中国药师，2017，20（06）：1139-1141.
[5] 温蓓，何刚.头孢妥仑匹酯细粒治疗儿童急性细菌性鼻窦炎的随机、双盲双模拟临床试验[J].四川医学，2016，37（11）：1220-1224.
[6] 戴伟中，谢斌，范钢，盛力，陈钢.头孢妥仑匹酯的合成[J].中国医药工业杂志，2015，46（08）：803-805.
[7] Yamada Ken-ichi，Konishi Takehito，Nakano Mayu，Fujii Shintaro，Cadou Romain，Yamamoto Yasutomo，Tomioka Kiyoshi.Radical one-pot α，β-dual and β-mono-oxymethylation of alkylidenemalonate.[J].Pubmed，2012，77（13）.
[8] 饒志明，李少芳，郑清霞，蔡文联，陈育琳.热解吸/化学发光联用技术检测空气中痕量苯[J].分析化学，2009，37（01）：127-130.
[9] 张明发.头孢妥仑匹酯的抗菌活性[J].上海医药，2005（07）：307-310.
[10] 孔祥和，方黎，郑海洋，周留柱，顾学军，朱元，马靖，张为俊.大气压力下双光子电离痕量苯系物检测实验研究[J].光电子·激光，2005（06）：722-725.
关键词：头孢托仑匹酯;苯残留;气相色谱法
一、前言
头孢托仑匹酯是第四代口服头孢菌素，对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有广泛而强大的抗菌作用，临床疗效确切，安全稳定，口服吸收好、体内分布广、血药浓度高等特点，应用广泛。
头孢妥仑匹酯的常规溶剂二氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲苯、DMF的检测方法已经收录在药典或已有报道，而工艺中间接引入的溶剂杂质的研究报道较少。从用药安全性角度，原料中引入的杂质，特别是毒性较大的杂质也是必须有相应的检测方法来检测控制。头孢托仑匹酯中用到的常规溶剂丙酮、甲苯的生产工艺中用到苯，苯在中国药典和《残留溶剂指导原则》（ICH Q3C）中被定义为一类溶剂，规定其限度为2ppm。痕量溶剂残留的检测方法已有报道中多为质谱法、热解吸/化学发光联用技术、双光子电离技术，操作复杂、且依赖昂贵仪器。目前尚未见头孢托仑匹酯中苯残留检测方法的报道。本文参考中国药典通则0861残留溶剂检查法和相关文献，建立了顶空气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中基因毒性杂质苯残留量的方法，该方法仪器通用易得、简便、准确、灵敏。
二、仪器与试药
Agilent 7890B气相色谱仪（美国安捷仑公司）;
十万分之一分析天平（北京赛多利斯天平有限公司）
头孢托仑匹酯（齐鲁制药有限公司提供，批号20190606）
N，N-二甲基甲酰胺（DMF，Merk公司，色谱纯）
苯（国药集团化使有限公司，色谱纯）
三、方法与结果
1.色谱条件
色谱柱：HP-5，30m*0.53mm*5.0μm;检测器：FID;载气：氮气;载气流速：6.5mL/min;柱温：50℃保持10分钟，然后以30℃/min的速率升温至180℃;进样口温度：150℃;检测器温度：250℃;顶空炉温度：70℃;平衡时间：30min;进样量1ml
2.溶液配制
对照溶液：精密量取5.7μl苯于盛有适量DMF的50ml容量瓶中，用DMF稀释并定容混匀，为对照品储备液。精密量取上述溶液0.5ml于盛有适量DMF的50ml容量瓶中，用DMF稀释并定容混匀，为对照溶液。
供试品溶液：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加DMF使其溶解并稀释定容混匀，为供试品溶液。
系统适用性溶液：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加对照溶液使其溶解并稀释定容混匀，为供试品与对照品混合溶液。
3.专属性考察
取空白溶剂DMF、对照溶液、供试品溶液、系统适用性溶液分别进样，记录色谱图。结果表明，空白对测定无干扰，各组分分离度9.13（>1.5），被测组分峰理论塔板数5320（>5000），对称因子1.09（在0.75～1.5范围内）。供试品中其它组分对测定结果无影响，方法专属性好。
4.检测限和定量限的测定
取对照溶液，逐步稀释，用信噪比法计算检测限LOD、定量限LOQ。使苯的信噪比（S/N）为3時，即为苯的检测限，浓度为0.025μg/ml，换算样品浓度后为0.05ppm;使苯的信噪比（S/N）为10时，即为苯的定量限，浓度为0.12μg/ml，换算样品浓度后为0.2ppm。
5.线性与范围
精密量取对照品贮备溶液0.1、0.4、0.8、1.0、1.5ml，分别置于100ml容量瓶中，加DMF稀释定容，配置成10%、40%、80%、100%、150%限度溶度的溶液，进样记录色谱图。以峰面积为纵坐标，以溶液浓度为横坐标，进行线性回归，得线性方程：Y=1.4893X+1.1568，相关系数r=0.9995，表明峰面积与浓度线性关系良好。
6.准确度（回收率）试验
精密量取对照品贮备溶液0.8、1.0、1.2ml，分别置于100ml容量瓶中，约相当于限度的80%、100%、120%，加入已测定苯残留量的供试品（批号：20190606，未检出）约5000mg，用DMF溶解并稀释定容，摇匀，作为回收率测试溶液，每个浓度配置3份，进样记录色谱图，计算苯的量、回收率、平均回收率和RSD，结果80%、100%、120%浓度水平的回收率分别为95.6%、99.2%、92.9%。表明苯的回收率都在80%～120%之间，平均回收率95.9%，RSD2.23%，符合要求。
7.精密度（重复性）试验
取对照溶液，进样记录图谱，平行操作6次，结果苯的峰面积的RSD为4.13%，表明该方法精密度良好。
8.耐用性考察
在其它条件不变的情况下，考察了进样口温度（150℃±3℃）、流速（6.5ml/min±0.3ml/min）、柱温（50℃±3℃）、顶空炉温（70±3℃）、顶空平衡时间（30min±5min）及不同批号色谱柱，测试结果的变化，结果表明，在以上条件变化范围内，获得的色谱图苯与前后峰的分离度均≥1.5。
四、结论
通过以上实验，本方法准确灵敏耐用性好，可用于头孢托仑匹酯中苯残留检测。具体方法如下：采用HP-530m*0.53mm*5.0μm色谱柱、FID检测器，载气为氮气，流速：6.5mL/min，柱温为50℃保持10分钟，然后以30℃/min的速率升温至180℃，进样口温度150℃，检测器温度250℃，顶空炉温度70℃平衡30min，分流进样量1ml。测定法：取供试品5000.0mg，精密称定，置10ml容量瓶中，加DMF使其溶解并稀释定容混匀，为供试品溶液。精密量取苯对照品储备液0.5ml，稀释至50ml为对照溶液。顶空进样记录色谱图，按照外标法以峰面积计算。 参考文献
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[3] 王晨，李东伟，崔晨辉，王晶，王彦广.气相色谱法测定头孢妥仑匹酯中N，N-二甲基甲酰胺残留量[J].中国抗生素杂志，2019，44（10）：1163-1166.
[4] 刘春玲，刘春菊，刘希，陈玉洁，李志怀，隰艳华.UPLC-MS/MS法检测雷迪帕韦原料药中潜在基因毒性杂质残留量[J].中国药师，2017，20（06）：1139-1141.
[5] 温蓓，何刚.头孢妥仑匹酯细粒治疗儿童急性细菌性鼻窦炎的随机、双盲双模拟临床试验[J].四川医学，2016，37（11）：1220-1224.
[6] 戴伟中，谢斌，范钢，盛力，陈钢.头孢妥仑匹酯的合成[J].中国医药工业杂志，2015，46（08）：803-805.
[7] Yamada Ken-ichi，Konishi Takehito，Nakano Mayu，Fujii Shintaro，Cadou Romain，Yamamoto Yasutomo，Tomioka Kiyoshi.Radical one-pot α，β-dual and β-mono-oxymethylation of alkylidenemalonate.[J].Pubmed，2012，77（13）.
[8] 饒志明，李少芳，郑清霞，蔡文联，陈育琳.热解吸/化学发光联用技术检测空气中痕量苯[J].分析化学，2009，37（01）：127-130.
[9] 张明发.头孢妥仑匹酯的抗菌活性[J].上海医药，2005（07）：307-310.
[10] 孔祥和，方黎，郑海洋，周留柱，顾学军，朱元，马靖，张为俊.大气压力下双光子电离痕量苯系物检测实验研究[J].光电子·激光，2005（06）：722-725.