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摘要：银杏聚戊烯醇是银杏叶中重要的药用、保健作用的有效成分，其主要以乙酸酯的形式存在，少量以游离醇的形式存在，在提取银杏聚戊烯醇的过程中将聚戊烯乙酸酯水解为聚戊烯醇，可提高银杏叶中聚戊烯醇的含量。在单因素试验的基础上，利用响应面法优化银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的工艺，以影响聚戊烯乙酸酯水解的料液比、时间、温度为主要作用因子，采用高效液相色谱法（HPLC）测定聚戊烯醇含量，经Design-Expert软件分析数据，得到银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的最佳条件为料液比1 g ∶3 mL、水解时间90 min、水解温度37 ℃，在此最佳工艺组合条件下，银杏雄株叶片中聚戊烯醇得率的实际测定值达1536%。
关键词：银杏雄株；聚戊烯乙酸酯；聚戊烯醇；响应面法；HPLC
中图分类号： R2842文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0170-04
[HJ14mm]
收稿日期：2016-04-06
基金项目：江苏省连云港市科技局农业科技攻关项目（编号：CN1301）。
作者简介：葛金涛（1987—），男，山东潍坊人，硕士，助理研究员，主要从事果树与观赏树木遗传育种研究。E-mail：672643419@qqcom。
通信作者：吴秋月，硕士，农艺师，主要从事果树与观赏树木遗传育种研究。E-mail：709728218@qqcom。[HJ]
银杏聚戊烯醇是由15～21个异戊烯单元构成的线性类脂化合物，具有重要的药用和保健价值。研究表明，银杏聚戊烯醇是人体多萜醇的结构类似物，是合成人体多萜醇及其衍生物的最佳中间体，代谢后可形成多萜醇以补充人体内多萜醇的不足，而多萜醇是人体生理活动不可缺少的元素之一，因此，银杏聚戊烯醇具有重要的生理和药用价值，可以提高人体的免疫功能、抑制癌细胞转移[3]、促进肝细胞再生[4]以及增强膜的融合[5]等。
银杏聚戊烯醇主要以乙酸酯（polyprenyl acetates，PPAs）的形式存在于银杏叶片中，少量以游离醇（polyprenyl alcohols，PPs）的形式存在。因此，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析聚戊烯醇时，需对样品进行水解处理，将PPAs转变为PPs。水解采用的皂化剂一般有2种，一种是水-碱溶液，如NaOH-H2O、KOH-H2O等；另一种是醇-碱溶液，如NaOH-乙醇/甲醇等。Tateyama等采用浓度较高的KOH溶液在70 ℃以上进行水解[6-7]。Huh等采用弱碱K2CO3溶液水解，反应时间长达12 h[8]。杨克迪等采用5% NaOH甲醇溶液在常温下水解样品，聚戊烯乙酸酯完全水解的时间仅需25 h[9]。综合前人的研究经验，本试验采用5% NaOH甲醇溶液作为皂化剂，利用单因素试验和响应面法（response surface methodology，RSM）探讨料液比、水解时间及水解温度3个影响因子及各影响因子之间的交互作用对银杏雄株叶片中聚戊烯乙酸酯水解的影响规律，进而得到最佳的工艺组合。
1材料与方法
11试验材料
银杏（Ginkgo biloba L）叶片，于2011年9月取自扬州大学银杏园内栽培管理一致的20株十三年生雄株，每株采集100片。采摘后洗净，沥干，105 ℃杀青，80 ℃烘干，粉碎过80目筛得银杏叶粉末，置于-18 ℃密封保存。聚戊烯醇标准品（C90-Prenol），购自瑞典Larodan公司；水解用的石油醚、正己烷、乙酸乙酯，均为分析纯，HPLC用的甲醇、異丙醇、正己烷为色谱纯，200～300目硅胶，HPLC用水为超纯水，其他用水为双蒸水。
高效液相色谱仪（Shimadzu LC-10A），购自日本岛津公司；紫外检测器（SPD-10A），购自日本岛津公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自上海森信实验仪器有限公司；超声波清洗器，购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；高速冷冻离心机，购自湖南长沙平凡仪器仪表有限公司。
12银杏叶聚戊烯醇提取液的制备
称取3 g银杏叶粉末进行超声波提取（正己烷为提取溶剂，料液比1 g ∶12 mL，超声时间60 min，温度38 ℃），过滤得正己烷提取液，超声波水解（皂化剂为5%氢氧化钠甲醇溶液），取上层黄色澄清液体，旋转蒸发，硅胶柱层析（洗脱液为石油醚和乙酸乙酯，体积比为9 ∶1，收集20 mL），蒸发至膏状，溶于2 mL正己烷中，制备成聚戊烯醇提取液，即正已烷浸提液。
13聚戊烯醇标准曲线的绘制
131色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（150 mm×46 mm，5 μm），流动相：异丙醇、甲醇、正己烷、水，体积比为 50 ∶25 ∶10 ∶2，流速1 mL/min，于215 nm处检测，柱温 27 ℃，进样量为10 μL。
132聚戊烯醇标准曲线的制作
研究发现，采用不同链长的聚戊烯醇标准品测试样品，对样品测试结果的相对标准误差小于3%，在使用HPLC定量分析聚戊烯醇时，可以认为不同链长的聚戊烯醇对应的各色谱峰具有相同的响应因子[10]。因此，本试验选取C90-Prenol作为外标物来建立聚戊烯醇HPLC的定量方法。
精确称取20 mg C90-Prenol标准品，溶于100 mL正己烷中，得浓度为020 mg/mL的C90-Prenol标准液。分别吸取5、10、20、40 mL C90-Prenol标准液至50 mL容量瓶中，用正己烷定容，得002、004、008、016 mg/mL标准溶液，取各标准溶液进样10 μL，测定其峰面积，得到聚戊烯醇标准曲线：y=5×10-7x-2950 6，r2=0998 7[11]。 133聚戊烯醇得率的计算
聚戊烯醇得率：y=[SX（][（s1 s2 s3）-B]×n×VA×m[SX）]×100%。
式中：s1、s2、s3分别为HPLC中C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面积；B为标准曲线回归方程的截距；n为稀释倍数；V为样品体积；A为标准曲线回归方程的斜率；m为银杏雄株叶片的质量[11]。
14单因素试验
聚戊烯乙酸酯的水解为液-液两相反应，本试验采用超声波，使两相可以充分接触，料液比、水解温度和水解时间对聚戊烯乙酸酯的水解有很大的影响，因此，设计以料液比、水解时间、水解温度为因子的单因素试验，根据聚戊烯醇的得率，考察各因素对银杏雄株叶片中聚戊烯乙酸酯水解的影响。在本试验中，料液比是超声提取得到的聚戊烯醇的正己烷浸提液和皂化剂的体积比，皂化剂采用5% NaOH-甲醇溶液。
141料液比对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，设置正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液的体积比分别为1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5，在45 ℃下水解120 min，每个处理重复3次。
142水解时间对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液料液比为1 g ∶3 mL、水解温度为 45 ℃ 条件下分别水解60、 90、120、150、180 min，每个处理重复3次。
143水解温度对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液料液比为1 g ∶3 mL的条件下，分别在25、35、45、55、65 ℃水解温度下水解120 min，每个处理重复3次。
15响应面优化试验
响应面优化试验采用Box-Behnken中心组合试验设计原理[12-13]，在单因素试验的基础上，为了获取最佳的水解工艺条件，将影响聚戊烯乙酸酯水解较大的3个因素作为试验因素进行优化试验，因素编码及变量水平如表1所示。
2结果与分析
21单因素试验结果与分析
211料液比对聚戊烯醇得率的影响
由图1可知，随着料液比的增大，聚戊烯醇的得率总体呈增大的趋势，当料液比为1 g ∶4 mL时，聚戊烯醇得率达到最大，继续增大料液比，聚戊烯醇的得率无明显变化。因此，确定银杏叶中聚戊烯乙酸酯水解的最佳料液比为1 g ∶4 mL。
212水解时间对聚戊烯醇得率的影响
由图2可知，随着水解时间的延长，聚戊烯醇的得率呈先上升后下降的趋势，当水解时间为90 min时，聚戊烯醇的得率达到最大值。聚戊烯乙酸酯的水解时间对聚戊烯醇的得率有明显的影响，水解时间过短，聚戊烯乙酸酯不能完全水解，水解时间过长，可能会破坏聚戊烯醇的结构，导致聚戊烯醇的得率降低。因此，确定银杏叶聚戊烯乙酸酯水解的最佳时间为90 min。
213水解温度对聚戊烯醇得率的影响
由图3可知，随着水[CM（25]解温度的上升，聚戊烯醇的得率逐渐增大，当水解温度为
55 ℃时，聚戊烯醇的得率达到最大值，随后继续升高水解温度，聚戊烯醇的得率反而下降，这是由于聚戊烯乙酸酯水解反应是一个吸热的过程，水解温度越高，越有利于聚戊烯乙酸酯水解，但是水解温度过高，正己烷挥发加快，使得聚戊烯醇得率降低。因此，确定银杏叶聚戊烯乙酸酯水解的最佳温度为55 ℃。
22响应面优化试验结果与分析
根据Box-Behnken中心组合试验设计，以料液比（A）、水解时间（B）和水解温度（C）为自变量，以聚戊烯醇得率（Y）为响应值，设计了17组试验，试验设计及结果如表2所示。
221回归模型建立及方差分析
采用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行回归分析， 经过拟合得到3个因素（A、B、C）与响应值（Y）之间的回归方程为Y=1280-0069A 0120B-0330C-0063AB-2917×10-3AC 0190BC 0240A2-0350B2-0200C2，R2=0934，说明该回归方程的擬合程度较好，试验误差小，能较好地分析和预测聚戊烯醇的得率随水解条件变化而变化的情况，因此，可使用该方程模拟真实的3因子3水平的分析[14-15]。
由表3可知，模型的F值为1107，P值为0002 3，表示该模型是极显著的（P<001），各个试验因素的F值和P值表示各因素对响应值的影响程度。综合来看，在这个模型中，C、A2、B2有较高的显著性（P<005），说明水解温度对聚戊烯乙酸酯水解反应的影响最为显著， 料液比、水解时间、水解
温度对聚戊烯乙酸酯水解影响的显著性表现为水解温度>水解时间>料液比。
222因素间交互作用的分析
根据回归方程利用 Design-Expert软件作出不同影响因子的等高线，由图4可知，水解时间与水解温度的交互作用明显，对聚戊烯乙酸酯水解的影响较为显著；由图5、图6可知，料液比与水解时间、料液比与水解温度之间的交互作用均不显著。
利用Design-Expert软件对回归方程求解，得到聚戊烯乙酸酯水解的最佳方案，最佳条件为料液比1 g ∶3 mL、水解时间9132 min、水解温度3707 ℃，此时聚戊烯醇的理论最佳得率为1728%。
23最佳工艺参数组合验证 为了进一步验证该回归模型的准确性和有效性， 按上述最优水解组合进行聚戊烯乙酸酯水解反应[16-17]，同时考虑到实际操作，在料液比为1 g ∶3 mL、水解温度为40 ℃、水解時间为95 min的条件下水解聚戊烯乙酸酯，重复3次。由表4可知，3组聚戊烯醇的得率均较高，平均值达到1536%，与理论预测值相比绝对误差为0192%，说明在该最佳工艺参数组合条件下，聚戊烯乙酸酯的水解率较高。
3讨论
响应面设计法是一种最优化的统计学试验设计方法，目前已广泛应用于各种生物技术领域[15-16]。采用单因素试验结合响应面设计法，对聚戊烯乙酸酯水解过程中的各因素进行了优化，并建立了拟合度较高的数学模型，得出最佳水解条件为料液比1 g ∶3 mL、水解时间95 min、水解温40 ℃，在此最佳工艺组合条件下，银杏雄株叶片中聚戊烯醇的得率实际测定值可达1536%。
参考文献：
R[DD（-1][HT6]ˇ[DD）]ezanka T，Votruba J Chromatography of long chain alcohols （polyprenols） from animal and plant sources[J] Journal of Chromatography A，2001，936（1/2）：95-110
Hartley M D，Imperiali B At the membrane frontier：a prospectus on the remarkable evolutionary conservation of polyprenols and polyprenyl-phosphates[J] Archives of Biochemistry and Biophysics，2012，517（2）：83-97
[3]Trompezinski S，Bonneville M，Pernet I，et al Gingko biloba extract reduces VEGF and CXCL-8/IL-8 levels in keratinocytes with cumulative effect with epigallocatechin-3-gallate[J] Archives of Dermatological Research，2010，302（3）：183-189
[4]Janas T，Chojnacki T S E，Walinska K Modulation of properties of phospholipid membranes by the long-chain polyprenol （C160）[J] Chemistry
关键词：银杏雄株；聚戊烯乙酸酯；聚戊烯醇；响应面法；HPLC
中图分类号： R2842文献标志码：
文章编号：1002-1302（2017）16-0170-04
[HJ14mm]
收稿日期：2016-04-06
基金项目：江苏省连云港市科技局农业科技攻关项目（编号：CN1301）。
作者简介：葛金涛（1987—），男，山东潍坊人，硕士，助理研究员，主要从事果树与观赏树木遗传育种研究。E-mail：672643419@qqcom。
通信作者：吴秋月，硕士，农艺师，主要从事果树与观赏树木遗传育种研究。E-mail：709728218@qqcom。[HJ]
银杏聚戊烯醇是由15～21个异戊烯单元构成的线性类脂化合物，具有重要的药用和保健价值。研究表明，银杏聚戊烯醇是人体多萜醇的结构类似物，是合成人体多萜醇及其衍生物的最佳中间体，代谢后可形成多萜醇以补充人体内多萜醇的不足，而多萜醇是人体生理活动不可缺少的元素之一，因此，银杏聚戊烯醇具有重要的生理和药用价值，可以提高人体的免疫功能、抑制癌细胞转移[3]、促进肝细胞再生[4]以及增强膜的融合[5]等。
银杏聚戊烯醇主要以乙酸酯（polyprenyl acetates，PPAs）的形式存在于银杏叶片中，少量以游离醇（polyprenyl alcohols，PPs）的形式存在。因此，采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）分析聚戊烯醇时，需对样品进行水解处理，将PPAs转变为PPs。水解采用的皂化剂一般有2种，一种是水-碱溶液，如NaOH-H2O、KOH-H2O等；另一种是醇-碱溶液，如NaOH-乙醇/甲醇等。Tateyama等采用浓度较高的KOH溶液在70 ℃以上进行水解[6-7]。Huh等采用弱碱K2CO3溶液水解，反应时间长达12 h[8]。杨克迪等采用5% NaOH甲醇溶液在常温下水解样品，聚戊烯乙酸酯完全水解的时间仅需25 h[9]。综合前人的研究经验，本试验采用5% NaOH甲醇溶液作为皂化剂，利用单因素试验和响应面法（response surface methodology，RSM）探讨料液比、水解时间及水解温度3个影响因子及各影响因子之间的交互作用对银杏雄株叶片中聚戊烯乙酸酯水解的影响规律，进而得到最佳的工艺组合。
1材料与方法
11试验材料
银杏（Ginkgo biloba L）叶片，于2011年9月取自扬州大学银杏园内栽培管理一致的20株十三年生雄株，每株采集100片。采摘后洗净，沥干，105 ℃杀青，80 ℃烘干，粉碎过80目筛得银杏叶粉末，置于-18 ℃密封保存。聚戊烯醇标准品（C90-Prenol），购自瑞典Larodan公司；水解用的石油醚、正己烷、乙酸乙酯，均为分析纯，HPLC用的甲醇、異丙醇、正己烷为色谱纯，200～300目硅胶，HPLC用水为超纯水，其他用水为双蒸水。
高效液相色谱仪（Shimadzu LC-10A），购自日本岛津公司；紫外检测器（SPD-10A），购自日本岛津公司；电热恒温鼓风干燥箱，购自上海森信实验仪器有限公司；超声波清洗器，购自江苏省昆山市超声仪器有限公司；旋转蒸发仪，购自上海亚荣生化仪器厂；高速冷冻离心机，购自湖南长沙平凡仪器仪表有限公司。
12银杏叶聚戊烯醇提取液的制备
称取3 g银杏叶粉末进行超声波提取（正己烷为提取溶剂，料液比1 g ∶12 mL，超声时间60 min，温度38 ℃），过滤得正己烷提取液，超声波水解（皂化剂为5%氢氧化钠甲醇溶液），取上层黄色澄清液体，旋转蒸发，硅胶柱层析（洗脱液为石油醚和乙酸乙酯，体积比为9 ∶1，收集20 mL），蒸发至膏状，溶于2 mL正己烷中，制备成聚戊烯醇提取液，即正已烷浸提液。
13聚戊烯醇标准曲线的绘制
131色谱条件
色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（150 mm×46 mm，5 μm），流动相：异丙醇、甲醇、正己烷、水，体积比为 50 ∶25 ∶10 ∶2，流速1 mL/min，于215 nm处检测，柱温 27 ℃，进样量为10 μL。
132聚戊烯醇标准曲线的制作
研究发现，采用不同链长的聚戊烯醇标准品测试样品，对样品测试结果的相对标准误差小于3%，在使用HPLC定量分析聚戊烯醇时，可以认为不同链长的聚戊烯醇对应的各色谱峰具有相同的响应因子[10]。因此，本试验选取C90-Prenol作为外标物来建立聚戊烯醇HPLC的定量方法。
精确称取20 mg C90-Prenol标准品，溶于100 mL正己烷中，得浓度为020 mg/mL的C90-Prenol标准液。分别吸取5、10、20、40 mL C90-Prenol标准液至50 mL容量瓶中，用正己烷定容，得002、004、008、016 mg/mL标准溶液，取各标准溶液进样10 μL，测定其峰面积，得到聚戊烯醇标准曲线：y=5×10-7x-2950 6，r2=0998 7[11]。 133聚戊烯醇得率的计算
聚戊烯醇得率：y=[SX（][（s1 s2 s3）-B]×n×VA×m[SX）]×100%。
式中：s1、s2、s3分别为HPLC中C85、C90、C95聚戊烯醇的峰面积；B为标准曲线回归方程的截距；n为稀释倍数；V为样品体积；A为标准曲线回归方程的斜率；m为银杏雄株叶片的质量[11]。
14单因素试验
聚戊烯乙酸酯的水解为液-液两相反应，本试验采用超声波，使两相可以充分接触，料液比、水解温度和水解时间对聚戊烯乙酸酯的水解有很大的影响，因此，设计以料液比、水解时间、水解温度为因子的单因素试验，根据聚戊烯醇的得率，考察各因素对银杏雄株叶片中聚戊烯乙酸酯水解的影响。在本试验中，料液比是超声提取得到的聚戊烯醇的正己烷浸提液和皂化剂的体积比，皂化剂采用5% NaOH-甲醇溶液。
141料液比对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，设置正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液的体积比分别为1 ∶1、1 ∶2、1 ∶3、1 ∶4、1 ∶5，在45 ℃下水解120 min，每个处理重复3次。
142水解时间对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液料液比为1 g ∶3 mL、水解温度为 45 ℃ 条件下分别水解60、 90、120、150、180 min，每个处理重复3次。
143水解温度对银杏雄株叶片聚戊烯乙酸酯水解的影响
准确称取3 g银杏雄株叶片粉末5份，根据“12”节中的试验方法得到5份聚戊烯醇的正己烷浸提液，然后在正己烷浸提液与5% NaOH-甲醇溶液料液比为1 g ∶3 mL的条件下，分别在25、35、45、55、65 ℃水解温度下水解120 min，每个处理重复3次。
15响应面优化试验
响应面优化试验采用Box-Behnken中心组合试验设计原理[12-13]，在单因素试验的基础上，为了获取最佳的水解工艺条件，将影响聚戊烯乙酸酯水解较大的3个因素作为试验因素进行优化试验，因素编码及变量水平如表1所示。
2结果与分析
21单因素试验结果与分析
211料液比对聚戊烯醇得率的影响
由图1可知，随着料液比的增大，聚戊烯醇的得率总体呈增大的趋势，当料液比为1 g ∶4 mL时，聚戊烯醇得率达到最大，继续增大料液比，聚戊烯醇的得率无明显变化。因此，确定银杏叶中聚戊烯乙酸酯水解的最佳料液比为1 g ∶4 mL。
212水解时间对聚戊烯醇得率的影响
由图2可知，随着水解时间的延长，聚戊烯醇的得率呈先上升后下降的趋势，当水解时间为90 min时，聚戊烯醇的得率达到最大值。聚戊烯乙酸酯的水解时间对聚戊烯醇的得率有明显的影响，水解时间过短，聚戊烯乙酸酯不能完全水解，水解时间过长，可能会破坏聚戊烯醇的结构，导致聚戊烯醇的得率降低。因此，确定银杏叶聚戊烯乙酸酯水解的最佳时间为90 min。
213水解温度对聚戊烯醇得率的影响
由图3可知，随着水[CM（25]解温度的上升，聚戊烯醇的得率逐渐增大，当水解温度为
55 ℃时，聚戊烯醇的得率达到最大值，随后继续升高水解温度，聚戊烯醇的得率反而下降，这是由于聚戊烯乙酸酯水解反应是一个吸热的过程，水解温度越高，越有利于聚戊烯乙酸酯水解，但是水解温度过高，正己烷挥发加快，使得聚戊烯醇得率降低。因此，确定银杏叶聚戊烯乙酸酯水解的最佳温度为55 ℃。
22响应面优化试验结果与分析
根据Box-Behnken中心组合试验设计，以料液比（A）、水解时间（B）和水解温度（C）为自变量，以聚戊烯醇得率（Y）为响应值，设计了17组试验，试验设计及结果如表2所示。
221回归模型建立及方差分析
采用Design-Expert软件对表2中的试验数据进行回归分析， 经过拟合得到3个因素（A、B、C）与响应值（Y）之间的回归方程为Y=1280-0069A 0120B-0330C-0063AB-2917×10-3AC 0190BC 0240A2-0350B2-0200C2，R2=0934，说明该回归方程的擬合程度较好，试验误差小，能较好地分析和预测聚戊烯醇的得率随水解条件变化而变化的情况，因此，可使用该方程模拟真实的3因子3水平的分析[14-15]。
由表3可知，模型的F值为1107，P值为0002 3，表示该模型是极显著的（P<001），各个试验因素的F值和P值表示各因素对响应值的影响程度。综合来看，在这个模型中，C、A2、B2有较高的显著性（P<005），说明水解温度对聚戊烯乙酸酯水解反应的影响最为显著， 料液比、水解时间、水解
温度对聚戊烯乙酸酯水解影响的显著性表现为水解温度>水解时间>料液比。
222因素间交互作用的分析
根据回归方程利用 Design-Expert软件作出不同影响因子的等高线，由图4可知，水解时间与水解温度的交互作用明显，对聚戊烯乙酸酯水解的影响较为显著；由图5、图6可知，料液比与水解时间、料液比与水解温度之间的交互作用均不显著。
利用Design-Expert软件对回归方程求解，得到聚戊烯乙酸酯水解的最佳方案，最佳条件为料液比1 g ∶3 mL、水解时间9132 min、水解温度3707 ℃，此时聚戊烯醇的理论最佳得率为1728%。
23最佳工艺参数组合验证 为了进一步验证该回归模型的准确性和有效性， 按上述最优水解组合进行聚戊烯乙酸酯水解反应[16-17]，同时考虑到实际操作，在料液比为1 g ∶3 mL、水解温度为40 ℃、水解時间为95 min的条件下水解聚戊烯乙酸酯，重复3次。由表4可知，3组聚戊烯醇的得率均较高，平均值达到1536%，与理论预测值相比绝对误差为0192%，说明在该最佳工艺参数组合条件下，聚戊烯乙酸酯的水解率较高。
3讨论
响应面设计法是一种最优化的统计学试验设计方法，目前已广泛应用于各种生物技术领域[15-16]。采用单因素试验结合响应面设计法，对聚戊烯乙酸酯水解过程中的各因素进行了优化，并建立了拟合度较高的数学模型，得出最佳水解条件为料液比1 g ∶3 mL、水解时间95 min、水解温40 ℃，在此最佳工艺组合条件下，银杏雄株叶片中聚戊烯醇的得率实际测定值可达1536%。
参考文献：
R[DD（-1][HT6]ˇ[DD）]ezanka T，Votruba J Chromatography of long chain alcohols （polyprenols） from animal and plant sources[J] Journal of Chromatography A，2001，936（1/2）：95-110
Hartley M D，Imperiali B At the membrane frontier：a prospectus on the remarkable evolutionary conservation of polyprenols and polyprenyl-phosphates[J] Archives of Biochemistry and Biophysics，2012，517（2）：83-97
[3]Trompezinski S，Bonneville M，Pernet I，et al Gingko biloba extract reduces VEGF and CXCL-8/IL-8 levels in keratinocytes with cumulative effect with epigallocatechin-3-gallate[J] Archives of Dermatological Research，2010，302（3）：183-189
[4]Janas T，Chojnacki T S E，Walinska K Modulation of properties of phospholipid membranes by the long-chain polyprenol （C160）[J] Chemistry