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摘要：在本研究中我们通过甲基化特异性PCR（MSP）方法：检测Wnt信号通路拮抗基因HDPR1在53例骨髓增生异常综合征（MDS）患者中的甲基化情况，并分析其甲基化与患者临床指标及预后之间的关系，结果：显示HDPR1的甲基化频率为34.0%，同时发现在骨髓原始细胞比例≥5%的患者中HDPR1甲基化阳性率明显增高（P=0.019），并在MDS分型之间存在差异性（P=0.019），与WPSS预后评分有显著相关性（P=0.037），此外HDPR1甲基化组的总体生存时间要短于非甲基化组（P=0.017）。表明MDS患者中存在HDPR1基因一定程度的甲基化，并在MDS疾病进展中发挥重要作用。
关键词：骨髓增生异常综合征；HDPR1；甲基化
骨髓增生异常综合征（MDS）是起源于造血干/祖细胞的一组高度异质性克隆性疾病[1]。有研究发现在MDS中存在抑癌基因的甲基化，并与MDS的转白、预后的有关[2， 3]。Wnt信号通路是一个对细胞的分化和增殖起重要调节作用的途径，而人类Dapper因子1（HDPR1）是爪蟾属中Dapper（Dpr）蛋白的人類同源体，可以抑制Wnt信号通路的传递[4]。目前研究表明Wnt拮抗基因的甲基化改变和Wnt信号通路的异常活化参与了肿瘤的发生和发展[5]。本文将对HDPR1基因在MDS患者中的甲基化情况进行研究，探讨其甲基化改变与患者临床指标及总体生存之间的关系。
1.材料与方法
1.1 研究对象
选取2008年至2010年在本院诊断为骨髓增生异常综合征的患者53例和非肿瘤对照19例。其中男性 31例，女性 22例，中位年龄52岁。所有患者均采取抗凝骨髓液送检，此外加入了MDS急变细胞株（SKM-1）的检测。
1.2 实验方法
甲基化特异性PCR（MSP）：基因组DNA抽提及MSP方法见文献[6]，甲基化引物序列及反应条件见参考文献[7]。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
1.3 数据分析和处理：
所有统计分析均采用SPSS 17.0统计软件，HDPR1甲基化与MDS患者临床指标的关系采用χ2检验。总体生存（OS）时间计算采用Kaplan-Meier方法，比较采用Log-Rank法。P <0.05定义为有统计学意义。
2.结果
2.1 HDPR1基因甲基化与临床指标之间的关系
在53例MDS患者中HDPR1基因甲基化阳性18例（34.0%），甲基化PCR结果见图1。我们将MDS-RA和MDS-RCMD作为低风险组，MDS-RAEB 1型和MDS-RAEB 2型作为高风险组进行比较；根据WPSS评分将极低危组、低危组和中危组作为低风险组，高危组和极高危组作为高风险组进行比较。统计结果分析表明：在骨髓原始细胞比例≥5%的患者中HDPR1甲基化阳性率明显高于骨髓原始细胞比例<5%的患者（P=0.019）；而且HDPR1甲基化阳性率还与MDS分型和WPSS预后评分有显著相关性（P=0.019；P=0.037），此外HDPR1基因在平均红细胞容积（MCV）<100fl的患者中甲基化频率明显高于平均红细胞容积（MCV）≥100fl的患者（50.0%和27.8%，P=0.016）；但与其他临床指标无明显相关性，详见表1。
2.2. HDPR1基因甲基化与MDS预后的关系
比较HDPR1甲基化情况与MDS患者的总体生存时间发现，甲基化阳性组为20.5个月，阴性组为46.3个月，差异有统计学意义（P=0.017），见图2。
3.讨论
研究表明Wnt信号通路在干细胞的自我更新和增殖中发挥重要作用，因此它的异常激活与肿瘤的发生和发展存在关系[8]。同时Wnt信号通路在调节造血干细胞的生长增殖和分化中也发挥着重要作用，有研究表明在血液肿瘤中引起Wnt信号通路异常激活的主要机制之一是Wnt拮抗基因的甲基化[9]。
HDPR1基因是爪蟾属Dapper蛋白的同系物，其基因定位于人类14染色体，编码由799个氨基酸组成的蛋白质[10]。HDPR1是新近发现的Wnt信号通路拮抗基因，在Tai-on Yan等[7]研究中发现肝癌组织中存在HDPR1表达下调，并与β-catenin积聚存在相关性，进行甲基化分析后发现存在HDPR1启动子区域的甲基化，提示HDPR1甲基化是Wnt信号通路异常激活的主要机制。而在血液系统肿瘤中，也有HDPR1基因甲基化与Wnt信号通路异常活化的报道[9]。本研究结果显示，HDPR1基因在34%的MDS患者中存在甲基化，在骨髓原始细胞比例增高的患者中甲基化阳性率明显升高，并在MDS分型之间存在差异性，表明HDPR1基因可能在MDS疾病进展中发挥重要作用。同时HDPR1基因在WPSS评分高风险组中的甲基化阳性率明显高于低风险组，且甲基化组患者的中位生存时间要明显短于非甲基化组患者，说明HDPR1甲基化提示MDS患者可能有不良预后。此外HDPR1基因在MCV<100fl的患者HDPR1基因甲基化频率明显高于MCV≥100fl的患者，结合Wang[11]报道提示MCV<100fl是MDS患者的独立不良预后因素，表明HDPR1基因甲基化可能参与了MDS疾病的预后分层。
综上所述，HDPR1基因在MDS患者中存在一定的甲基化频率，可能在MDS疾病进展和预后分层中发挥重要作用。
参考文献：
[1] Steensma D P， Tefferi A. The myelodysplastic syndrome（s）： a perspective and review highlighting current controversies[J]. Leuk Res，2003，27（2）：95-120. [2] Shen L， Kantarjian H， Guo Y， et al. DNA methylation predicts survival and response to therapy in patients with myelodysplastic syndromes[J]. J Clin Oncol，2010，28（4）：605-613.
[3] Aggerholm A， Holm M S， Guldberg P， et al. Promoter hypermethylation of p15INK4B， HIC1， CDH1， and ER is frequent in myelodysplastic syndrome and predicts poor prognosis in early-stage patients[J]. Eur J Haematol，2006，76（1）：23-32.
[4] Zhang L， Gao X， Wen J， et al. Dapper 1 antagonizes Wnt signaling by promoting dishevelled degradation[J]. J Biol Chem，2006，281（13）：8607-8612.
[5] Griffiths E A， Gore S D， Hooker C， et al. Acute myeloid leukemia is characterized by Wnt pathway inhibitor promoter hypermethylation[J]. Leuk Lymphoma，2010，51（9）：1711-1719.
[6] Herman J G， Graff J R， Myohanen S， et al. Methylation-specific PCR： a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（18）：9821-9826.
[7] Yau T O， Chan C Y， Chan K L， et al. HDPR1， a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling， is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma： involvement of methylation-mediated gene silencing[J]. Oncogene，2005，24（9）：1607-1614.
[8] Reya T， Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature，2005，434（7035）：843-850.
[9] Roman-Gomez J， Cordeu L， Agirre X， et al. Epigenetic regulation of Wnt-signaling pathway in acute lymphoblastic leukemia[J]. Blood，2007，109（8）：3462-3469.
[10] Katoh M， Katoh M. Identification and characterization of human DAPPER1 and DAPPER2 genes in silico[J]. Int J Oncol，2003，22（4）：907-913.
[11] Wang H， Wang X， Xu X， et al. Mean corpuscular volume predicts prognosis in MDS patients with abnormal karyotypes[J]. Ann Hematol，2010，89（7）：671-679.
关键词：骨髓增生异常综合征；HDPR1；甲基化
骨髓增生异常综合征（MDS）是起源于造血干/祖细胞的一组高度异质性克隆性疾病[1]。有研究发现在MDS中存在抑癌基因的甲基化，并与MDS的转白、预后的有关[2， 3]。Wnt信号通路是一个对细胞的分化和增殖起重要调节作用的途径，而人类Dapper因子1（HDPR1）是爪蟾属中Dapper（Dpr）蛋白的人類同源体，可以抑制Wnt信号通路的传递[4]。目前研究表明Wnt拮抗基因的甲基化改变和Wnt信号通路的异常活化参与了肿瘤的发生和发展[5]。本文将对HDPR1基因在MDS患者中的甲基化情况进行研究，探讨其甲基化改变与患者临床指标及总体生存之间的关系。
1.材料与方法
1.1 研究对象
选取2008年至2010年在本院诊断为骨髓增生异常综合征的患者53例和非肿瘤对照19例。其中男性 31例，女性 22例，中位年龄52岁。所有患者均采取抗凝骨髓液送检，此外加入了MDS急变细胞株（SKM-1）的检测。
1.2 实验方法
甲基化特异性PCR（MSP）：基因组DNA抽提及MSP方法见文献[6]，甲基化引物序列及反应条件见参考文献[7]。扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察。
1.3 数据分析和处理：
所有统计分析均采用SPSS 17.0统计软件，HDPR1甲基化与MDS患者临床指标的关系采用χ2检验。总体生存（OS）时间计算采用Kaplan-Meier方法，比较采用Log-Rank法。P <0.05定义为有统计学意义。
2.结果
2.1 HDPR1基因甲基化与临床指标之间的关系
在53例MDS患者中HDPR1基因甲基化阳性18例（34.0%），甲基化PCR结果见图1。我们将MDS-RA和MDS-RCMD作为低风险组，MDS-RAEB 1型和MDS-RAEB 2型作为高风险组进行比较；根据WPSS评分将极低危组、低危组和中危组作为低风险组，高危组和极高危组作为高风险组进行比较。统计结果分析表明：在骨髓原始细胞比例≥5%的患者中HDPR1甲基化阳性率明显高于骨髓原始细胞比例<5%的患者（P=0.019）；而且HDPR1甲基化阳性率还与MDS分型和WPSS预后评分有显著相关性（P=0.019；P=0.037），此外HDPR1基因在平均红细胞容积（MCV）<100fl的患者中甲基化频率明显高于平均红细胞容积（MCV）≥100fl的患者（50.0%和27.8%，P=0.016）；但与其他临床指标无明显相关性，详见表1。
2.2. HDPR1基因甲基化与MDS预后的关系
比较HDPR1甲基化情况与MDS患者的总体生存时间发现，甲基化阳性组为20.5个月，阴性组为46.3个月，差异有统计学意义（P=0.017），见图2。
3.讨论
研究表明Wnt信号通路在干细胞的自我更新和增殖中发挥重要作用，因此它的异常激活与肿瘤的发生和发展存在关系[8]。同时Wnt信号通路在调节造血干细胞的生长增殖和分化中也发挥着重要作用，有研究表明在血液肿瘤中引起Wnt信号通路异常激活的主要机制之一是Wnt拮抗基因的甲基化[9]。
HDPR1基因是爪蟾属Dapper蛋白的同系物，其基因定位于人类14染色体，编码由799个氨基酸组成的蛋白质[10]。HDPR1是新近发现的Wnt信号通路拮抗基因，在Tai-on Yan等[7]研究中发现肝癌组织中存在HDPR1表达下调，并与β-catenin积聚存在相关性，进行甲基化分析后发现存在HDPR1启动子区域的甲基化，提示HDPR1甲基化是Wnt信号通路异常激活的主要机制。而在血液系统肿瘤中，也有HDPR1基因甲基化与Wnt信号通路异常活化的报道[9]。本研究结果显示，HDPR1基因在34%的MDS患者中存在甲基化，在骨髓原始细胞比例增高的患者中甲基化阳性率明显升高，并在MDS分型之间存在差异性，表明HDPR1基因可能在MDS疾病进展中发挥重要作用。同时HDPR1基因在WPSS评分高风险组中的甲基化阳性率明显高于低风险组，且甲基化组患者的中位生存时间要明显短于非甲基化组患者，说明HDPR1甲基化提示MDS患者可能有不良预后。此外HDPR1基因在MCV<100fl的患者HDPR1基因甲基化频率明显高于MCV≥100fl的患者，结合Wang[11]报道提示MCV<100fl是MDS患者的独立不良预后因素，表明HDPR1基因甲基化可能参与了MDS疾病的预后分层。
综上所述，HDPR1基因在MDS患者中存在一定的甲基化频率，可能在MDS疾病进展和预后分层中发挥重要作用。
参考文献：
[1] Steensma D P， Tefferi A. The myelodysplastic syndrome（s）： a perspective and review highlighting current controversies[J]. Leuk Res，2003，27（2）：95-120. [2] Shen L， Kantarjian H， Guo Y， et al. DNA methylation predicts survival and response to therapy in patients with myelodysplastic syndromes[J]. J Clin Oncol，2010，28（4）：605-613.
[3] Aggerholm A， Holm M S， Guldberg P， et al. Promoter hypermethylation of p15INK4B， HIC1， CDH1， and ER is frequent in myelodysplastic syndrome and predicts poor prognosis in early-stage patients[J]. Eur J Haematol，2006，76（1）：23-32.
[4] Zhang L， Gao X， Wen J， et al. Dapper 1 antagonizes Wnt signaling by promoting dishevelled degradation[J]. J Biol Chem，2006，281（13）：8607-8612.
[5] Griffiths E A， Gore S D， Hooker C， et al. Acute myeloid leukemia is characterized by Wnt pathway inhibitor promoter hypermethylation[J]. Leuk Lymphoma，2010，51（9）：1711-1719.
[6] Herman J G， Graff J R， Myohanen S， et al. Methylation-specific PCR： a novel PCR assay for methylation status of CpG islands[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（18）：9821-9826.
[7] Yau T O， Chan C Y， Chan K L， et al. HDPR1， a novel inhibitor of the WNT/beta-catenin signaling， is frequently downregulated in hepatocellular carcinoma： involvement of methylation-mediated gene silencing[J]. Oncogene，2005，24（9）：1607-1614.
[8] Reya T， Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature，2005，434（7035）：843-850.
[9] Roman-Gomez J， Cordeu L， Agirre X， et al. Epigenetic regulation of Wnt-signaling pathway in acute lymphoblastic leukemia[J]. Blood，2007，109（8）：3462-3469.
[10] Katoh M， Katoh M. Identification and characterization of human DAPPER1 and DAPPER2 genes in silico[J]. Int J Oncol，2003，22（4）：907-913.
[11] Wang H， Wang X， Xu X， et al. Mean corpuscular volume predicts prognosis in MDS patients with abnormal karyotypes[J]. Ann Hematol，2010，89（7）：671-679.