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【摘要】 目的：观察供精体外受精-胚胎移植术（D-IVF）中采用密度梯度离心法联合上游法处理精液后的胚胎情况。方法：回顾本院2013年1月-2014年7月D-IVF 135个周期，观察冷冻精液复苏后经采用密度梯度离心法联合上游法处理后精子总活动率、前向运动精子活动率等精液情况，以及受精以后的受精率、卵裂率、临床妊娠率，对照组为同期46个因丈夫梗阻性无精行ICSI的周期。结果：处理后精子总活动率、前向运动精子活动率均大大提高，但是精子密度却大大下降，处理前后比较差异均有统计学意义（P<0.05）；受精以后的实验室资料和对照组比较，各项参数差异无统计学意义（P>0.05）。结论：密度梯度离心法联合上游法的精液处理方法在D-IVF中是一种稳定可行的方法。
【关键词】 供精； 体外受精-胚胎移植； 梯度密度离心法联合上游法； 冷冻精液
对男性不可逆的无精子症、严重的少精子症、弱精子症、畸精子症及男方有不宜生育的严重遗传性疾病的治疗需行供精人工授精（Artificial Insemination by Donor，AID）或供精体外受精（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer with Donor Semen，D-IVF）胚胎移植辅助生育。在D-IVF中，冷冻精液复苏后的精液处理非常重要，笔者将采用密度梯度离心联合上游法用于冷冻精液的处理，并对处理前后精子的运动参数进行了分析，同时对处理好的精子受精后对其受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率进行了分析，和同期因丈夫梗阻性无精子采用（Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration，PESA）PESA-ICSI（Intracytoplasmic Sperm Injection）对照组46个周期比较，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 供精组：因为丈夫无精子症，严重少、弱、畸形精子症，或患有遗传性疾病不宜生育者，在本院采用供者冷冻精液接受D-IVF治疗的135个周期，女方年龄（30.21±3.38）岁，不孕年限（5.43±2.65）年。对照组：2013年1月-2014年7月因丈夫梗阻性无精子采用PESA-ICSI治疗的46个周期，女方年龄（28.87±4.43）岁，不孕年限（4.42±2.58）年。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）
1.2 方法 控制性超排方案：按本院常规进行[1]。
1.2.1 精子来源及准备 冷冻供精来源于广东省计划生育科学研究所精子库。精液质量符合国家卫生部要求，供受者血型相符。冷冻精液于37 ℃水浴中解冻10 min，然后进行以下处理：（1）取分装有1 mL 90%浓度梯度液的一支尖底离心管Ⅰ然后沿管壁缓慢加入1 mL 45%密度梯度液，注意两者间应形成清晰的界面。做好标记后将液化好的精液用移液管缓缓加1～2 mL于45%密度梯度液之上，注意也应保持其与45%密度梯度液之间的界面清晰，300 g/min离心20 min。精液黏稠度较高或精子密度较低时，可适当延长离心时间。（2）离心结束后，取另一只尖底离心管Ⅱ并做好标记，然后加入3 mL洗精液，接着用巴斯特吸管将Ⅰ中的沉淀（保留底部0.2～0.3 mL）小心转入Ⅱ中并混匀，再接着200 g/min离心5 min。（3）离心结束后，弃上清，接着将沉淀团混匀，再接着沿管壁倾斜小心加入适量洗精液，松盖、倾斜45 °于工作培养箱内（37 ℃的CO2培养箱）上游1 h。（4）上游结束后的精子悬液计数。
1.2.2 IVF授精 计算处理好的精子密度，按照每个卵子周围10 万条左右的精子密度进行微滴受精，授精后卵子置于37 ℃，6% CO2培养。
1.2.3 胚胎评分 采用ASEBIR评分系统，D3胚胎，7～8个细胞且大小均匀、碎片<10%、无液泡、透明带正常者为优质胚胎[2]。
1.2.4 黄体支持及妊娠 移植14 d后查血、尿HCG呈阳性，第35天行超生检查见到孕囊并有心管搏动为临床妊娠。
1.3 统计学处理 使用SPSS 16.5软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 处理前后的精子情况比较 冷冻精子复苏后明显高于精子优选后的密度，冷冻精子复苏后的活动率和前向运动的百分率明显低于精子优选后的活动率和前向运动的百分比，两者比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率比较 供精组135个周期共获得933枚卵子，其中739枚受精成功，2PN卵裂数为628枚，2PN数为639枚，2PN优质胚胎数为420个，临床妊娠周期数为75个周期。对照组的46个周期共获卵452枚，其中成熟卵子数为385枚，299枚受精成功，2PN卵裂数为289枚，2PN数为294枚，2PN优质胚胎数为172个，临床妊娠周期数为25个周期。两组受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
3 讨论
随着辅助技术的发展，供精体外受精-胚胎移植（D-IVF）已经成为男性不育的一种常规的治疗方法，为许多不孕不育的夫妇解决了生育问题。按照卫生部的要求，D-IVF中的精液必须由精子库提供，人类精子库提供的冷冻精液具有使用方便、避免感染病毒的优点，已在临床上得到广泛应用。本院自1985年开展人工授精技术，1991年开始对精子冷冻技术的研究。精子库精液按WHO供精者要求及正常精液标准筛选，2001年8月后按国家卫生部关于人类精子库管理办法及人类精子库技术规范有关要求进行，并采用程序冷冻法进行精液冷冻保存，复苏率与活动率等指标均符合国家有关规定，供精IVF组的精液全部采用本院精子库提供的精液。DNA完整性是目前检测精子质量的主要指标之一，有研究表明精子的低温冷冻保存对精子DNA不稳定和精子超微结构的变化等有影响[3-6]。从本文研究来看，供精组和对照ICSI组在受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率差异无统计学意义，有研究表明精子的冷冻并不完全影响精子的受精能力，本文的研究与此符合[7-9]。冷冻精液在原有的精液成分上加入了冷冻保护剂，将精子从中优选出来要选择合适的精液处理方法。精子优选的方法很多，常用的方法是上游法和密度梯度离心法[10-11]。起初，笔者采用上游法处理冷冻精液，但在处理的过程中却发现冷冻精液在上游处理后虽然在活动率上有了提高，但在数量上却不理想，由于上游法精子要克服重力向上游，而精子经过低温保存后在冷冻复温过程中可受到一定的损伤，导致能回收到的精子很少；然后笔者改用SpermGrad密度梯度离心法处理，得到的精子在数量上有了很大的提高，但是活动率却不理想，镜检时发现很大比例的IM（Immotility，IM）级精子，这部分的精子为什么也通过密度梯度离心而到达了管底？可能是冷冻精子复苏后，一部分精子本身是原地不动的精子，它们的密度也一样可以穿透两层不连续的梯度液而到达管底，还有一部分精子复苏后可能活动率本身就不是很好，马上经过离心等处理后成为了不动的精子，它们也同样穿透两层不连续的梯度液而到达管底，这样导致比较大比例的IM级精子。已有研究证实一定比例的精子的活动力和活动率与精子的生育力明显相关，于是在密度梯度离心后经过一次洗涤后用0.2～0.5 mL的受精液上游，上游的时间本中心为1 h，关于上游的时间不能太短，也不能太长，如果太短则没有充分将活动精子和非活动精子分开，如果太长如将优选后的精子在培养液中孵育2.5 h，呈快速直线前向运动的精子有25%自发发生顶体反应[12-15]。因此，在实施辅助生育技术时，尽量缩短精子在体外环境中的时间，以免精子自发发生顶体反应而失去受精能力，本中心使用1 h的上游时间是合适的，而且将上游液体回收后精子的活动率很高，与优化处理前也就是复苏后精子的活动率和前向运动比较差异有统计学意义（P<0.05）。 对供精IVF来说，精子还是比较宝贵的，既要充分将活动精子与非活动精子分开又要尽可能多的筛选到活动的精子，密度梯度离心法联合上游法达到了这一目的，从而给良好的受精和临床妊娠情况提供了一定的保障。
参考文献
[1]陈瑞玲，李庆琨，韦相才，等.体外受精-胚胎移植术中使用冷冻供精及夫精的临床效果观察[J].中国男科学杂志，2003，17（4）：264-266.
[2] Alpha Scientists in Reproductive Medicine and ESHRE Special Interest Group of Embryology.The Istanbul consensus workshop on embryo assessment：proceedings of an expert meeting[J].Hum Reprod，2011，26（6）：1270-1283.
[3]刘红海.精子DNA完整性对夫精人工授精妊娠结局的影响研究[J].中国医学创新，2014，11（11）：45-46.
[4] Gonzalez-Marin C，Gosalvez J，Roy R.Types， causes， detection and repair of DNA fragmentation in animal and human sperm cells[J].Int J Mol Sci，2012，13（11）：14026-14052.
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[6] Stanic P，Tandara M，Sonicki Z， et al.Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of human semen[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2000，91（1）：65-70.
[7]伏晓敏，徐惠明，金爱华.冷冻精子受精能力的综合评价[J].男科学报，1999，5（2）：73-75.
[8]徐惠明，张军荣，富炜.人精子冷冻前后超微结构及受精能力的变化[J].浙江预防医学，2006，18（3）：4-5.
[9]张丹，谭丽，赵冬梅.三种不同来源精子行卵胞浆内单精子注射临床结局的比较[J].中国医学创新，2014，11（32）：11-13.
[10]王怀秀，李弘.辅助生育技术中精液处理的重要性[J].中国男科学杂志，2005，19（1）：2-5.
[11]李志凌，谢文燕.辅助生殖技术中的精液优选处理[J].生殖医学杂志，2007，16（3）：209-212.
[12] Sallam H N，Ezzeldin F，Sallam A，et al.Sperm velocity an morphology， female characteristics and the hypo-osmotic swelling test as predictors of fertilization potential：experience from the IVF model[J].Int J Fertil Womens Med，2003，48（2）：88-95.
[13] Cooper T G，Noonan E，Eckardstein V S，et al.World Health Organization reference values for human semen characteristics[J].Human Reproduction Update，2009，16（3）：231-245.
[14]王奇玲，唐立新，唐运革.生育力男性精液检测与计算机辅助分析参数的主成分分析[J].中国男科学，2010，24（11）：30-36.
[15]黄平治，李永海.男性不育[M].北京：科学技术文献出版社，1990：126.
（收稿日期：2015-04-29） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 供精； 体外受精-胚胎移植； 梯度密度离心法联合上游法； 冷冻精液
对男性不可逆的无精子症、严重的少精子症、弱精子症、畸精子症及男方有不宜生育的严重遗传性疾病的治疗需行供精人工授精（Artificial Insemination by Donor，AID）或供精体外受精（In Vitro Fertilization and Embryo Transfer with Donor Semen，D-IVF）胚胎移植辅助生育。在D-IVF中，冷冻精液复苏后的精液处理非常重要，笔者将采用密度梯度离心联合上游法用于冷冻精液的处理，并对处理前后精子的运动参数进行了分析，同时对处理好的精子受精后对其受精率、卵裂率、优质胚胎率、临床妊娠率进行了分析，和同期因丈夫梗阻性无精子采用（Percutaneous Epididymal Sperm Aspiration，PESA）PESA-ICSI（Intracytoplasmic Sperm Injection）对照组46个周期比较，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 供精组：因为丈夫无精子症，严重少、弱、畸形精子症，或患有遗传性疾病不宜生育者，在本院采用供者冷冻精液接受D-IVF治疗的135个周期，女方年龄（30.21±3.38）岁，不孕年限（5.43±2.65）年。对照组：2013年1月-2014年7月因丈夫梗阻性无精子采用PESA-ICSI治疗的46个周期，女方年龄（28.87±4.43）岁，不孕年限（4.42±2.58）年。两组一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）
1.2 方法 控制性超排方案：按本院常规进行[1]。
1.2.1 精子来源及准备 冷冻供精来源于广东省计划生育科学研究所精子库。精液质量符合国家卫生部要求，供受者血型相符。冷冻精液于37 ℃水浴中解冻10 min，然后进行以下处理：（1）取分装有1 mL 90%浓度梯度液的一支尖底离心管Ⅰ然后沿管壁缓慢加入1 mL 45%密度梯度液，注意两者间应形成清晰的界面。做好标记后将液化好的精液用移液管缓缓加1～2 mL于45%密度梯度液之上，注意也应保持其与45%密度梯度液之间的界面清晰，300 g/min离心20 min。精液黏稠度较高或精子密度较低时，可适当延长离心时间。（2）离心结束后，取另一只尖底离心管Ⅱ并做好标记，然后加入3 mL洗精液，接着用巴斯特吸管将Ⅰ中的沉淀（保留底部0.2～0.3 mL）小心转入Ⅱ中并混匀，再接着200 g/min离心5 min。（3）离心结束后，弃上清，接着将沉淀团混匀，再接着沿管壁倾斜小心加入适量洗精液，松盖、倾斜45 °于工作培养箱内（37 ℃的CO2培养箱）上游1 h。（4）上游结束后的精子悬液计数。
1.2.2 IVF授精 计算处理好的精子密度，按照每个卵子周围10 万条左右的精子密度进行微滴受精，授精后卵子置于37 ℃，6% CO2培养。
1.2.3 胚胎评分 采用ASEBIR评分系统，D3胚胎，7～8个细胞且大小均匀、碎片<10%、无液泡、透明带正常者为优质胚胎[2]。
1.2.4 黄体支持及妊娠 移植14 d后查血、尿HCG呈阳性，第35天行超生检查见到孕囊并有心管搏动为临床妊娠。
1.3 统计学处理 使用SPSS 16.5软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验，计数资料采用 字2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 处理前后的精子情况比较 冷冻精子复苏后明显高于精子优选后的密度，冷冻精子复苏后的活动率和前向运动的百分率明显低于精子优选后的活动率和前向运动的百分比，两者比较差异均有统计学意义（P<0.05），见表1。
2.2 两组的受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率比较 供精组135个周期共获得933枚卵子，其中739枚受精成功，2PN卵裂数为628枚，2PN数为639枚，2PN优质胚胎数为420个，临床妊娠周期数为75个周期。对照组的46个周期共获卵452枚，其中成熟卵子数为385枚，299枚受精成功，2PN卵裂数为289枚，2PN数为294枚，2PN优质胚胎数为172个，临床妊娠周期数为25个周期。两组受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表2。
3 讨论
随着辅助技术的发展，供精体外受精-胚胎移植（D-IVF）已经成为男性不育的一种常规的治疗方法，为许多不孕不育的夫妇解决了生育问题。按照卫生部的要求，D-IVF中的精液必须由精子库提供，人类精子库提供的冷冻精液具有使用方便、避免感染病毒的优点，已在临床上得到广泛应用。本院自1985年开展人工授精技术，1991年开始对精子冷冻技术的研究。精子库精液按WHO供精者要求及正常精液标准筛选，2001年8月后按国家卫生部关于人类精子库管理办法及人类精子库技术规范有关要求进行，并采用程序冷冻法进行精液冷冻保存，复苏率与活动率等指标均符合国家有关规定，供精IVF组的精液全部采用本院精子库提供的精液。DNA完整性是目前检测精子质量的主要指标之一，有研究表明精子的低温冷冻保存对精子DNA不稳定和精子超微结构的变化等有影响[3-6]。从本文研究来看，供精组和对照ICSI组在受精率、卵裂率、优质胚胎率和临床妊娠率差异无统计学意义，有研究表明精子的冷冻并不完全影响精子的受精能力，本文的研究与此符合[7-9]。冷冻精液在原有的精液成分上加入了冷冻保护剂，将精子从中优选出来要选择合适的精液处理方法。精子优选的方法很多，常用的方法是上游法和密度梯度离心法[10-11]。起初，笔者采用上游法处理冷冻精液，但在处理的过程中却发现冷冻精液在上游处理后虽然在活动率上有了提高，但在数量上却不理想，由于上游法精子要克服重力向上游，而精子经过低温保存后在冷冻复温过程中可受到一定的损伤，导致能回收到的精子很少；然后笔者改用SpermGrad密度梯度离心法处理，得到的精子在数量上有了很大的提高，但是活动率却不理想，镜检时发现很大比例的IM（Immotility，IM）级精子，这部分的精子为什么也通过密度梯度离心而到达了管底？可能是冷冻精子复苏后，一部分精子本身是原地不动的精子，它们的密度也一样可以穿透两层不连续的梯度液而到达管底，还有一部分精子复苏后可能活动率本身就不是很好，马上经过离心等处理后成为了不动的精子，它们也同样穿透两层不连续的梯度液而到达管底，这样导致比较大比例的IM级精子。已有研究证实一定比例的精子的活动力和活动率与精子的生育力明显相关，于是在密度梯度离心后经过一次洗涤后用0.2～0.5 mL的受精液上游，上游的时间本中心为1 h，关于上游的时间不能太短，也不能太长，如果太短则没有充分将活动精子和非活动精子分开，如果太长如将优选后的精子在培养液中孵育2.5 h，呈快速直线前向运动的精子有25%自发发生顶体反应[12-15]。因此，在实施辅助生育技术时，尽量缩短精子在体外环境中的时间，以免精子自发发生顶体反应而失去受精能力，本中心使用1 h的上游时间是合适的，而且将上游液体回收后精子的活动率很高，与优化处理前也就是复苏后精子的活动率和前向运动比较差异有统计学意义（P<0.05）。 对供精IVF来说，精子还是比较宝贵的，既要充分将活动精子与非活动精子分开又要尽可能多的筛选到活动的精子，密度梯度离心法联合上游法达到了这一目的，从而给良好的受精和临床妊娠情况提供了一定的保障。
参考文献
[1]陈瑞玲，李庆琨，韦相才，等.体外受精-胚胎移植术中使用冷冻供精及夫精的临床效果观察[J].中国男科学杂志，2003，17（4）：264-266.
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[4] Gonzalez-Marin C，Gosalvez J，Roy R.Types， causes， detection and repair of DNA fragmentation in animal and human sperm cells[J].Int J Mol Sci，2012，13（11）：14026-14052.
[5] Smith R，Kaune H，Parodi D，et al.Increased sperm DNA damage in patients with varicocele：relationship with seminal oxidative stress[J].Hum Reprod，2006，21（4）：986-993.
[6] Stanic P，Tandara M，Sonicki Z， et al.Comparison of protective media and freezing techniques for cryopreservation of human semen[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol，2000，91（1）：65-70.
[7]伏晓敏，徐惠明，金爱华.冷冻精子受精能力的综合评价[J].男科学报，1999，5（2）：73-75.
[8]徐惠明，张军荣，富炜.人精子冷冻前后超微结构及受精能力的变化[J].浙江预防医学，2006，18（3）：4-5.
[9]张丹，谭丽，赵冬梅.三种不同来源精子行卵胞浆内单精子注射临床结局的比较[J].中国医学创新，2014，11（32）：11-13.
[10]王怀秀，李弘.辅助生育技术中精液处理的重要性[J].中国男科学杂志，2005，19（1）：2-5.
[11]李志凌，谢文燕.辅助生殖技术中的精液优选处理[J].生殖医学杂志，2007，16（3）：209-212.
[12] Sallam H N，Ezzeldin F，Sallam A，et al.Sperm velocity an morphology， female characteristics and the hypo-osmotic swelling test as predictors of fertilization potential：experience from the IVF model[J].Int J Fertil Womens Med，2003，48（2）：88-95.
[13] Cooper T G，Noonan E，Eckardstein V S，et al.World Health Organization reference values for human semen characteristics[J].Human Reproduction Update，2009，16（3）：231-245.
[14]王奇玲，唐立新，唐运革.生育力男性精液检测与计算机辅助分析参数的主成分分析[J].中国男科学，2010，24（11）：30-36.
[15]黄平治，李永海.男性不育[M].北京：科学技术文献出版社，1990：126.
（收稿日期：2015-04-29） （本文编辑：周亚杰）