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摘要：目的 观察宣肺通腑方对脂多糖（LPS）诱导的急性肺损伤（ALI）大鼠肺组织髓样分化蛋白-2（MD-2）、核因子-κB（NF-κB）蛋白及其基因表达的影响，并探讨其作用机制。方法 Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、地塞米松组和宣肺通腑方大、中、小剂量组，每组8只。尾静脉注射LPS 6 mg/kg制备大鼠ALI模型。宣肺通腑方各组于造模前以15.12、7.56、3.78 g原药材/kg宣肺通腑方水煎液灌胃，1次/d，连续3 d；地塞米松组在造模前1 h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松。造模后9 h麻醉取材，采用免疫组化ABC法和实时荧光定量聚合酶链反应检测MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达，光镜下观察大鼠肺组织病理变化。结果 与正常组比较，模型组MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达均明显上调（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，地塞米松组和宣肺通腑方各组MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达明显降低（P<0.05，P<0.01）；地塞米松组和宣肺通腑方各剂量组比较差异无统计学意义（P>0.05）。病理观察结果显示，与正常组比较，模型组大鼠肺组织出现大片出血及坏死，炎症细胞大量浸润；宣肺通腑方各剂量组和地塞米松组大鼠肺组织病理改变明显轻于模型组，肺细支气管偶见炎症改变，水肿较轻，炎性细胞渗出较少。结论 宣肺通腑方能减轻ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其降低ALI大鼠MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达有关。
关键词：宣肺通腑方；急性肺损伤；髓样分化蛋白-2；核因子-κB；蛋白表达；基因表达；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.021
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0065-04
Abstract：Objective To investigate the effects of Xuanfeitongfufang Decoction on expressions of MD-2， NF-κB protein and its mRNA in lung of the rats with acute lung injury caused by LPS. Methods Wistar rats were randomly divided into normal group， model group， dexamethasone group and Xuanfeitongfufang Decoction large-， medium-， small-dose group， each group had eight rats. The ALI rat model was established by LPS tail-intravenous injection （6 mg/kg）. The rats in Xuanfeitongfufang Decoction groups were pretreated by Xuanfeitongfufang Decoction （15.12， 7.56， 3.78 g/kg） for 3 days before LPS induced ALI. The rats in dexamethasone group were pretreated by dexamethasone （5 mg/kg）. MD-2， NF-κB protein and its mRNA were measured by immunohistochemistry and PCR. The histopathology of the lung injury was observed by light microscope. Results Compared with normal group， the expression of MD-2， NF-κB protein and itsmRNA were obviously increased in model group （P<0.01）. Compared with model group， the expression of MD-2， NF-κB protein and its mRNA were obviously decreased in Xuanfeitongfufang Decoction groups and dexamethasone group （P<0.01）， and there was no obvious difference between Xuanfeitongfufang Decoction groups and dexamethasone group. Light microscope observation indicates that there were large areas of pulmonary hemorrhage and necrosis in model group. While in Xuanfeitongfufang Decoction group and dexamethasone group， the pathological manifestations were much more ameliorated than those of the model group. The lung bronchiale inflammation appeared occasionally， and the edema was lightly. Conclusion Xuanfeitongfufang Decoction can lessen the injury of lung tissue and has protective effects on rats with ALI， the mechanism is possibly related to the inhibition of the expressions of MD-2 and NF-κB protein and its mRNA in injured lung tissues. Key words：Xuanfeitongfufang Decoction；acute lung injury；MD-2；NF-κB；protein expression；mRNA expression；rats
髓样分化蛋白-2（MD-2）是结合在Toll样受体4 （TLR4）胞外区的一种髓样分化蛋白，与TLR4组成复合受体介导脂多糖（LPS）信号的跨膜转导，增强细胞经TLR4对LPS的反应，最终激活肺泡巨噬细胞核因子-κB （NF-κB）[1]。Schwartz等[2]研究表明，LPS激活NF-κB，进而诱导促炎因子大量生成是急性肺损伤（ALI）的关键发病环节，NF-κB激活可能是大量炎症反应基因表达的控制点，故降低NF-κB活性可能是治疗ALI的一个有效方案。我们既往研究表明，LPS致ALI的发病机制可能与TLR4及CD14 mRNA的表达升高有关，且宣肺通腑方能减轻LPS致ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其能降低LPS致ALI大鼠TLR4蛋白及其mRNA表达有关[3-4]。本研究观察宣肺通腑方对ALI大鼠肺组织MD-2、NF-κB蛋白及基因表达的影响，进一步探讨宣肺通腑方的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级Wistar雄性大鼠48只，体质量（220±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2010-005。专用标准颗粒饲料、水喂养。
1.2 药物
宣肺通腑方由炙麻黄、苦杏仁、石膏、甘草、瓜蒌皮、大黄6味中药按一定比例组成。浓缩成1 g原药材/mL的水煎液，高温高压灭菌，4 ℃冷藏备用。中药饮片均购自上海曙光医院东院。地塞米松，购自上海信谊百路达药业有限公司，批号1002022。
1.3 仪器
低温冷冻离心机3K15，Sigma（美国）；生物安全柜TYPE B2，Sigma（美国）；紫外杀毒车ZXC型，上海跃进医用光学器械厂；Real-time检测仪（7300Sequence Detection System），ABI-7300，ABI（美国）。
1.4 试剂
LPS冻干粉剂购自美国Sigma公司，批号L2630。MD-2：上游引物5'-GGAAATTGTTTGCCATG GAT-3'，下游引物5'-TGTGATGGCCCTTAGGAAA-3'；NF-κB：上游引物5'-GTGAACCTGTTCCAGGCATT-3'，下游引物5'-AGT CGAGGTCGTGGAGCCTTA-3'；β-actin：上游引物5'-AGC CATGTACGTAGCCATCC-3'，下游引物5'-TCTCAGCTG TGGTGGTGAAG-3'；5'端Fam修饰，3'端Tamra修饰。Trizol总RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。
2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
按随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松组和宣肺通腑方大、中、小剂量组，每组8只。除正常组外，其他组大鼠经尾静脉注射6 mg/kg LPS复制ALI模型[5]。宣肺通腑方各组在造模前灌胃3 d， 1次/d，第3日灌胃后2 h，经尾静脉注入LPS（6 mg/kg），地塞米松组造模前1 h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松。正常组和模型组在相应时点灌服等体积蒸馏水，宣肺通腑方各组用药量按人与动物的体表面积换算[6]，剂量分别为15.12、7.56、3.78 g原药材/kg。
2.2 标本采集
动物于造模后9 h，用戊巴比妥钠2.0 mg/kg腹腔麻醉。逐层解剖大鼠胸部组织，仔细分离肺脏，剔除结缔组织，用生理盐水清洗血液，滤纸吸干，整肺用分析天平称重并计算肺体指数。然后分离右肺上叶，用10%甲醛溶液固定，待检，用于病理检测及肺组织MD-2、NF-κB蛋白表达免疫组化检测；右肺下叶置于液氮罐中，作MD-2、NF-κB mRNA表达检测。
2.3 肺体指数测定
整肺取出后，用生理盐水清洗多余血液，用滤纸吸干水分后称重，计算肺体指数（肺质量/体质量）。
2.4 肺组织髓样分化蛋白-2、核因子-κB基因表达检测
按美国Invitrogen公司Trizol法提取总RNA后，反转录合成cDNA，在20 μL反应体系中分别加入样本RNA 2 μg、RT buffer（5×）4 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、N9随机引物1 μL、MMLV-RT 1 μL、RNAsin 1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL。加DEPC处理水到20 μL，混匀后于下列温度反应：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。PCR扩增：在50 μL反应体系中加入cDNA 5 μL、ddH2O 32 μL、PCR buffer（5×）10 μL，荧光探针0.5 μL、Taq酶1 μL、dNTPs 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL。扩增条件：93 ℃、2 min，93 ℃、45 s；55 ℃、1 min，10 cycles；93 ℃、30 s，55 ℃、45 s，30 cycles。数据采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，MD-2、NF-κB mRNA表达水平以其与β-actin的相对表达量表示。
2.5 肺组织髓样分化蛋白-2、核因子-κB蛋白表达检测
应用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件。采用免疫组织化学ABC法对结果进行图像采集和定量分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野，细胞核为蓝色，MD-2、NF-κB阳性细胞为棕黄色。计算每例样本的蛋白染色阳性细胞面积率（阳性细胞面积/总面积）。 2.6 病理观察
右上肺组织常规10%甲醛固定，逐级脱水，取1 cm×1 cm×0.3 cm石蜡包埋，用切片机切取1片，漂片，常规HE染色，光镜下观察组织变化。肺损伤的轻重程度评分方法参考文献[7]。0分：无白细胞浸润，间质无水肿，无实变和透明膜形成；1分：肺泡轻度充血，白细胞浸润，间质轻度水肿，无透明膜形成；2分：肺泡中度充血，肺泡内有较多白细胞和红细胞浸润，间质明显水肿，轻度实变；3分：肺泡严重出血，大量白细胞浸润，致肺实变和透明膜形成。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。所有数据均用—x±s表示，多组均数比较采用方差分析，组间两两比较用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 宣肺通腑方对大鼠肺体指数水平和肺组织病理积分的影响
与正常组比较，模型组大鼠肺体指数和肺组织病理积分明显升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方各剂量组大鼠肺体指数和肺组织病理积分明显降低（P<0.05，P<0.01）。见表1。
5 讨论
MD-2是TLR4的伴侣蛋白，能和TLR4在内质网/高尔基体结合，或直接分泌到细胞外形成可溶性蛋白，在TLR4激活并将LPS信号转入细胞内的过程中起到重要作用。MD-2主要与TLR4细胞外区结合，形成TLR4-MD-2复合体共同表达于细胞表面，辅助TLR4识别LPS或LPS-LBP（lipopolysaccharide-blinding protein）-CD14复合物，并将LPS锁定到结合位点上来[8]。MD-2可以调控TLR4在细胞内的分布，促进TLR4在细胞膜上的表达，放大TLR4在介导LPS跨膜信号转导过程中的作用[9]。除上述作用外，Tissieres等[10]发现MD-2还具有调理吞噬革兰阴性细菌的作用，因而MD-2被认为是一种急性期反应蛋白，在先天性免疫应答和获得性免疫应答中均发挥重要作用。MD-2是一种含有160个氨基酸的小分子蛋白，与TLR4的胞外区偶联共同表达于细胞膜，或以可溶性形式游离存在，因此对MD-2的调控应该成为治疗LPS所致组织器官损伤的有潜力靶点之一。
LPS首先与LBP形成复合物，然后与肺泡巨噬细胞上的CD14分子结合，在小分子分泌蛋白MD2的辅助下激活肺泡巨噬细胞膜上TLR4受体，进而通过MyD88依赖性与非依赖性两条途径连续激活多种信号转导通路，最终导致NF-κB的活化，启动炎症介质和细胞因子的转录[11-12]。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点发生特异结合并促进转录的核因子，典型的NF-kB为p65/p50异源二聚体结构，NF-κB激活后可调控一系列带有NF-κB活性位点的基因产物的生成，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，参与机体的各种免疫及炎性反应。感染或非感染炎性反应刺激因素均可激活肺组织和肺泡巨噬细胞的NF-κB，而活化的NF-κB可导致多种细胞因子基因表达增高，启动炎性反应的级联反应，导致肺泡内聚集浸润嗜中性粒细胞激活后产生呼吸爆发从而引发ALI[13]。
宣肺通腑方由麻杏石甘汤和宣白承气汤组成，方中炙麻黄宣肺平喘，苦杏仁、石膏、瓜蒌皮清肺化痰，大黄通腑泻热，甘草调和诸药，肺肠同治，应用宣肺通腑法达到防治ALI的目的。有研究表明，麻杏石甘汤及其配伍具有良好的抗ALI的药效作用，其作用机制可能与降低血清TNF-α及升高血清IL-10有关[14]。宣白承气汤可改善ALI患者的呼吸力学，其机制可能与调节促炎因子与抑制因子之间的平衡有关[15]，且我们既往研究表明，宣白承气汤方能减轻LPS致ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其降低肺组织TLR4、CD14及NF-κB mRNA表达有关[16-17]。
本实验结果表明，与正常组比较，模型组肺泡腔内充满炎性渗出物和出血，病理积分明显升高，表明模型复制成功，且模型组MD-2、NF-κB蛋白及其mRNA表达均明显升高，表明LPS致ALI发病机制与MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达升高有关。与模型组比较，宣肺通腑方各剂量组肺组织病理改变减轻，病理积分明显降低，且宣肺通腑方各剂量组肺体指数和MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达明显下降，表明宣肺通腑方对ALI有保护作用，其机制可能与其能降低LPS致ALI大鼠MD-2、NF-κB蛋白及其mRNA的表达有关。
参考文献：
[1] Everhart MB， Han W， Sherrill TP， et al. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury[J]. Immunology，2006，176：4995-5005.
[2] Schwartz MD， Moore EE， Moore FA， et a1. Nuclear factor-κB is activated in alveolar macripages from patients with acute respiratory distress syndrome[J]. Cict Care Med，1996，24（8）：1285-1292.
[3] 杨爱东，李文雯，王利霞，等.急性肺损伤大鼠肺组织TOLL样受体4及CD14 mRNA的表达[J].中国实验动物学学报，2011，19（3）：216-219.
[4] 吴中华，王利霞，杨爱东，等.宣肺通腑方对内毒素致急性肺损伤大鼠肺组织TLR4蛋白及其mRNA表达的影响[J].上海中医药大学学报，2011， 25（5）：66-69. [5] 李琦，钱桂生，张青，等.不同剂量脂多糖对大鼠急性肺损伤效应的观察[J].第三军医大学学报，2004，26（10）：871-873.
[6] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1996：1103.
[7] 张波，刘又宁.气管内吹气对机械通气相关性急性肺损伤保护作用的实验研究[J].中国危重病急救医学，2000，12（1）：42-47.
[8] Shimazu R， Akashi S， Ogata H， et al. MD-2， a molecule that confers lipopolysaccharide responsiveness on Toll-like receptor 4[J]. J Exp Med，1999，189：1777-1781.
[9] Samuvel DJ， Sundararaj KP， Nareika A， et al. Lactate boosts TLR4 signaling and NF-κB pathway-mediated gene transcription in macrophages via monocarboxylate transporters and MD-2 up- regulation[J]. J Immunol，2009，182（4）：2476-2484.
[10] Tissieres P， Pugin J. The role of MD-2 in the opsonophagocytosis of Gram-negative bacteria[J]. Curr Opin Infect Dis，2009，22（3）：286- 291.
[11] Moniek MM， Hunninghake GW. Activation of second messenger pathways in alveolar macrophages by endotoxin[J]. Eur Res Pir J， 2002，20：210-218.
[12] Everhart MB， Han W， Sherrill TP， et al. Duration and intensity of NF-κB activity determine the severity of endotoxin-induced acute lung injury[J]. J Immunology，2006，176：4995-5005.
[13] Crimi E， Slutsky AS. Inflammation and the acute respiratory distress syndrome[J]. Best Pract Res Clin Anaesthesiol，2004， 18（3）：477-492.
[14] 王伟东，施旭光，翟理祥，等.麻杏甘石汤及其配伍抗急性肺损伤大鼠的实验研究[J].中药材，2007，30（8）：984-989.
[15] 张忠，乔秋杰，向素英，等.宣白承气汤对急性肺损伤机械通气患者呼吸力学的影响[J].新中医，2010，42（8）：30-31.
[16] 苏中昊，杨爱东，王利霞，等.宣白承气汤对急性肺损伤大鼠肺组织CD14和NF-κB mRNA表达的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（5）：121-124.
[17] 苏中昊，杨爱东，王利霞，等.宣白承气汤对急性肺损伤大鼠肺组织脂多糖结合蛋白和Toll样受体4 mRNA表达的影响[J].南京中医药大学学报，2013，29（2）：156-159.
（收稿日期：2013-11-16；编辑：华强）
关键词：宣肺通腑方；急性肺损伤；髓样分化蛋白-2；核因子-κB；蛋白表达；基因表达；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.021
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0065-04
Abstract：Objective To investigate the effects of Xuanfeitongfufang Decoction on expressions of MD-2， NF-κB protein and its mRNA in lung of the rats with acute lung injury caused by LPS. Methods Wistar rats were randomly divided into normal group， model group， dexamethasone group and Xuanfeitongfufang Decoction large-， medium-， small-dose group， each group had eight rats. The ALI rat model was established by LPS tail-intravenous injection （6 mg/kg）. The rats in Xuanfeitongfufang Decoction groups were pretreated by Xuanfeitongfufang Decoction （15.12， 7.56， 3.78 g/kg） for 3 days before LPS induced ALI. The rats in dexamethasone group were pretreated by dexamethasone （5 mg/kg）. MD-2， NF-κB protein and its mRNA were measured by immunohistochemistry and PCR. The histopathology of the lung injury was observed by light microscope. Results Compared with normal group， the expression of MD-2， NF-κB protein and itsmRNA were obviously increased in model group （P<0.01）. Compared with model group， the expression of MD-2， NF-κB protein and its mRNA were obviously decreased in Xuanfeitongfufang Decoction groups and dexamethasone group （P<0.01）， and there was no obvious difference between Xuanfeitongfufang Decoction groups and dexamethasone group. Light microscope observation indicates that there were large areas of pulmonary hemorrhage and necrosis in model group. While in Xuanfeitongfufang Decoction group and dexamethasone group， the pathological manifestations were much more ameliorated than those of the model group. The lung bronchiale inflammation appeared occasionally， and the edema was lightly. Conclusion Xuanfeitongfufang Decoction can lessen the injury of lung tissue and has protective effects on rats with ALI， the mechanism is possibly related to the inhibition of the expressions of MD-2 and NF-κB protein and its mRNA in injured lung tissues. Key words：Xuanfeitongfufang Decoction；acute lung injury；MD-2；NF-κB；protein expression；mRNA expression；rats
髓样分化蛋白-2（MD-2）是结合在Toll样受体4 （TLR4）胞外区的一种髓样分化蛋白，与TLR4组成复合受体介导脂多糖（LPS）信号的跨膜转导，增强细胞经TLR4对LPS的反应，最终激活肺泡巨噬细胞核因子-κB （NF-κB）[1]。Schwartz等[2]研究表明，LPS激活NF-κB，进而诱导促炎因子大量生成是急性肺损伤（ALI）的关键发病环节，NF-κB激活可能是大量炎症反应基因表达的控制点，故降低NF-κB活性可能是治疗ALI的一个有效方案。我们既往研究表明，LPS致ALI的发病机制可能与TLR4及CD14 mRNA的表达升高有关，且宣肺通腑方能减轻LPS致ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其能降低LPS致ALI大鼠TLR4蛋白及其mRNA表达有关[3-4]。本研究观察宣肺通腑方对ALI大鼠肺组织MD-2、NF-κB蛋白及基因表达的影响，进一步探讨宣肺通腑方的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
清洁级Wistar雄性大鼠48只，体质量（220±20）g，上海中医药大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（沪）2010-005。专用标准颗粒饲料、水喂养。
1.2 药物
宣肺通腑方由炙麻黄、苦杏仁、石膏、甘草、瓜蒌皮、大黄6味中药按一定比例组成。浓缩成1 g原药材/mL的水煎液，高温高压灭菌，4 ℃冷藏备用。中药饮片均购自上海曙光医院东院。地塞米松，购自上海信谊百路达药业有限公司，批号1002022。
1.3 仪器
低温冷冻离心机3K15，Sigma（美国）；生物安全柜TYPE B2，Sigma（美国）；紫外杀毒车ZXC型，上海跃进医用光学器械厂；Real-time检测仪（7300Sequence Detection System），ABI-7300，ABI（美国）。
1.4 试剂
LPS冻干粉剂购自美国Sigma公司，批号L2630。MD-2：上游引物5'-GGAAATTGTTTGCCATG GAT-3'，下游引物5'-TGTGATGGCCCTTAGGAAA-3'；NF-κB：上游引物5'-GTGAACCTGTTCCAGGCATT-3'，下游引物5'-AGT CGAGGTCGTGGAGCCTTA-3'；β-actin：上游引物5'-AGC CATGTACGTAGCCATCC-3'，下游引物5'-TCTCAGCTG TGGTGGTGAAG-3'；5'端Fam修饰，3'端Tamra修饰。Trizol总RNA提取试剂、反转录和PCR扩增所需的酶及其他试剂均购自美国Invitrogen公司。
2 实验方法
2.1 分组、造模与给药
按随机数字表法将大鼠分为正常组、模型组、地塞米松组和宣肺通腑方大、中、小剂量组，每组8只。除正常组外，其他组大鼠经尾静脉注射6 mg/kg LPS复制ALI模型[5]。宣肺通腑方各组在造模前灌胃3 d， 1次/d，第3日灌胃后2 h，经尾静脉注入LPS（6 mg/kg），地塞米松组造模前1 h按5 mg/kg腹腔注射地塞米松。正常组和模型组在相应时点灌服等体积蒸馏水，宣肺通腑方各组用药量按人与动物的体表面积换算[6]，剂量分别为15.12、7.56、3.78 g原药材/kg。
2.2 标本采集
动物于造模后9 h，用戊巴比妥钠2.0 mg/kg腹腔麻醉。逐层解剖大鼠胸部组织，仔细分离肺脏，剔除结缔组织，用生理盐水清洗血液，滤纸吸干，整肺用分析天平称重并计算肺体指数。然后分离右肺上叶，用10%甲醛溶液固定，待检，用于病理检测及肺组织MD-2、NF-κB蛋白表达免疫组化检测；右肺下叶置于液氮罐中，作MD-2、NF-κB mRNA表达检测。
2.3 肺体指数测定
整肺取出后，用生理盐水清洗多余血液，用滤纸吸干水分后称重，计算肺体指数（肺质量/体质量）。
2.4 肺组织髓样分化蛋白-2、核因子-κB基因表达检测
按美国Invitrogen公司Trizol法提取总RNA后，反转录合成cDNA，在20 μL反应体系中分别加入样本RNA 2 μg、RT buffer（5×）4 μL、10 mmol/L dNTPs 1 μL、N9随机引物1 μL、MMLV-RT 1 μL、RNAsin 1 μL，0.1 mol/L DTT 2 μL。加DEPC处理水到20 μL，混匀后于下列温度反应：37 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。PCR扩增：在50 μL反应体系中加入cDNA 5 μL、ddH2O 32 μL、PCR buffer（5×）10 μL，荧光探针0.5 μL、Taq酶1 μL、dNTPs 0.5 μL、上下游引物各0.5 μL。扩增条件：93 ℃、2 min，93 ℃、45 s；55 ℃、1 min，10 cycles；93 ℃、30 s，55 ℃、45 s，30 cycles。数据采用ABI Prism 7300 SDS Software分析，MD-2、NF-κB mRNA表达水平以其与β-actin的相对表达量表示。
2.5 肺组织髓样分化蛋白-2、核因子-κB蛋白表达检测
应用IMS细胞图像分析系统医学图像分析软件。采用免疫组织化学ABC法对结果进行图像采集和定量分析。每张切片在高倍镜下随机选择不相重叠的3个视野，细胞核为蓝色，MD-2、NF-κB阳性细胞为棕黄色。计算每例样本的蛋白染色阳性细胞面积率（阳性细胞面积/总面积）。 2.6 病理观察
右上肺组织常规10%甲醛固定，逐级脱水，取1 cm×1 cm×0.3 cm石蜡包埋，用切片机切取1片，漂片，常规HE染色，光镜下观察组织变化。肺损伤的轻重程度评分方法参考文献[7]。0分：无白细胞浸润，间质无水肿，无实变和透明膜形成；1分：肺泡轻度充血，白细胞浸润，间质轻度水肿，无透明膜形成；2分：肺泡中度充血，肺泡内有较多白细胞和红细胞浸润，间质明显水肿，轻度实变；3分：肺泡严重出血，大量白细胞浸润，致肺实变和透明膜形成。
3 统计学方法
采用SPSS18.0统计软件进行分析。所有数据均用—x±s表示，多组均数比较采用方差分析，组间两两比较用LSD检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 宣肺通腑方对大鼠肺体指数水平和肺组织病理积分的影响
与正常组比较，模型组大鼠肺体指数和肺组织病理积分明显升高（P<0.05，P<0.01）。与模型组比较，地塞米松组、宣肺通腑方各剂量组大鼠肺体指数和肺组织病理积分明显降低（P<0.05，P<0.01）。见表1。
5 讨论
MD-2是TLR4的伴侣蛋白，能和TLR4在内质网/高尔基体结合，或直接分泌到细胞外形成可溶性蛋白，在TLR4激活并将LPS信号转入细胞内的过程中起到重要作用。MD-2主要与TLR4细胞外区结合，形成TLR4-MD-2复合体共同表达于细胞表面，辅助TLR4识别LPS或LPS-LBP（lipopolysaccharide-blinding protein）-CD14复合物，并将LPS锁定到结合位点上来[8]。MD-2可以调控TLR4在细胞内的分布，促进TLR4在细胞膜上的表达，放大TLR4在介导LPS跨膜信号转导过程中的作用[9]。除上述作用外，Tissieres等[10]发现MD-2还具有调理吞噬革兰阴性细菌的作用，因而MD-2被认为是一种急性期反应蛋白，在先天性免疫应答和获得性免疫应答中均发挥重要作用。MD-2是一种含有160个氨基酸的小分子蛋白，与TLR4的胞外区偶联共同表达于细胞膜，或以可溶性形式游离存在，因此对MD-2的调控应该成为治疗LPS所致组织器官损伤的有潜力靶点之一。
LPS首先与LBP形成复合物，然后与肺泡巨噬细胞上的CD14分子结合，在小分子分泌蛋白MD2的辅助下激活肺泡巨噬细胞膜上TLR4受体，进而通过MyD88依赖性与非依赖性两条途径连续激活多种信号转导通路，最终导致NF-κB的活化，启动炎症介质和细胞因子的转录[11-12]。NF-κB是一类能与多种基因启动子部位的κB位点发生特异结合并促进转录的核因子，典型的NF-kB为p65/p50异源二聚体结构，NF-κB激活后可调控一系列带有NF-κB活性位点的基因产物的生成，如肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等，参与机体的各种免疫及炎性反应。感染或非感染炎性反应刺激因素均可激活肺组织和肺泡巨噬细胞的NF-κB，而活化的NF-κB可导致多种细胞因子基因表达增高，启动炎性反应的级联反应，导致肺泡内聚集浸润嗜中性粒细胞激活后产生呼吸爆发从而引发ALI[13]。
宣肺通腑方由麻杏石甘汤和宣白承气汤组成，方中炙麻黄宣肺平喘，苦杏仁、石膏、瓜蒌皮清肺化痰，大黄通腑泻热，甘草调和诸药，肺肠同治，应用宣肺通腑法达到防治ALI的目的。有研究表明，麻杏石甘汤及其配伍具有良好的抗ALI的药效作用，其作用机制可能与降低血清TNF-α及升高血清IL-10有关[14]。宣白承气汤可改善ALI患者的呼吸力学，其机制可能与调节促炎因子与抑制因子之间的平衡有关[15]，且我们既往研究表明，宣白承气汤方能减轻LPS致ALI大鼠肺组织损伤，对肺损伤有保护作用，其机制可能与其降低肺组织TLR4、CD14及NF-κB mRNA表达有关[16-17]。
本实验结果表明，与正常组比较，模型组肺泡腔内充满炎性渗出物和出血，病理积分明显升高，表明模型复制成功，且模型组MD-2、NF-κB蛋白及其mRNA表达均明显升高，表明LPS致ALI发病机制与MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达升高有关。与模型组比较，宣肺通腑方各剂量组肺组织病理改变减轻，病理积分明显降低，且宣肺通腑方各剂量组肺体指数和MD-2、NF-κB蛋白及其基因表达明显下降，表明宣肺通腑方对ALI有保护作用，其机制可能与其能降低LPS致ALI大鼠MD-2、NF-κB蛋白及其mRNA的表达有关。
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（收稿日期：2013-11-16；编辑：华强）