论文部分内容阅读
摘要：目的 建立蟅虫创愈胶囊的提取工艺。方法 通过小鼠扭体镇痛实验，考察水提工艺和醇提工艺对蟅虫创愈胶囊镇痛作用的影响，确定提取溶剂和工艺。采用正交试验，以出膏率、正丁醇浸出率、川续断皂苷Ⅵ含量为评价指标，以溶剂用量、提取时间、提取次数为因素，考察提取工艺。结果 50%乙醇提取物与水提取物镇痛作用相当，结合生产成本考虑采用水提方法。最佳提取工艺条件为：溶剂用量20倍，提取时间150 min，提取3次。结论 该提取工艺切实可行。
关键词：蟅虫创愈胶囊；正交试验；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.025
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0080-03
Abstract：Objective To establish the extraction process of Zhechong Chuangyu Capsule. Methods The difference of analgesic effect of water extraction and alcohol extraction in mice was observed by body-torsion test to determine the extract solvent. With the rate of aqueous extraction， n-butyl alcohol extraction and asperosaponin Ⅵ as evaluating indicator， the influencing factors including solvent volume， time and times of extraction were investegated to evaluate extracting procedure by orthogonal experiment. Results There was no obvious difference in analgesic effect between water extraction and alcohol extraction. Given the requirement of produce， aqueous extraction was a better choice. The optimum extracting condition was extracted 3 times with 20 folds volume of solvent， and extraction time was 150 minutes. Conclusion The extraction process is feasible to be applied into production.
Key words：Zhechong Chuangyu Capsule；orthogonal experiment；extraction process
蟅虫创愈胶囊组方为兰州市中医医院临床经验方，由土鳖虫、续断、骨碎补等8味药组成，一直以散剂形式应用于骨伤科临床，治疗急性发作期跌打损伤。但散剂粉末细碎、比表面积大，易吸潮结块，造成有效成分损失。且该散剂中含有龙骨、牡蛎矿石类药物，对胃肠具有一定刺激性，患者依从性差。为减小用量，提高疗效，将散剂改为胶囊剂。根据处方各药材性质，将龙骨等药材直接粉碎加入，将骨碎补等5味药材进行水提，利用正交试验设计安排试验，优选最佳提取工艺。
1 仪器、试药与动物
2 方法
2.1 出膏率测定
取土鳖虫、续断、骨碎补等5味药材，按处方比例称取80 g，粉碎，用水提取[1-4]。收集水提液，60 ℃以下减压浓缩至适宜体积，准确量取10 mL，共计2份。其中1份置于恒重的蒸发皿中，低温干燥至一定程度，105 ℃干燥至恒重，计算出膏率。
2.2 正丁醇浸出率测定
按“2.1”项下方法制得浸膏粉。取2 g浸膏粉加水20 mL溶解，加水饱和正丁醇萃取2次，20 mL/次。合并正丁醇层，置恒重蒸发皿中蒸干，干燥至恒重，计算其浸出率。
2.3 提取溶剂的筛选
通过扭体镇痛试验[5]初步观察原工艺、水提工艺和醇提工艺对该制剂药效的影响，从而确定提取溶剂。48只小鼠，适应性饲养1 d，按体质量随机分为模型组、散剂组、水提物组和醇提物组，每组12只。通过临床用药量折算，各组小鼠给药剂量分别为：散剂组0.617 g/kg（全草粉），水提物组0.345 g/kg（0.56 g药粉相当于1 g原药材），醇提物组0.314 g/kg（0.51 g药粉相当于1 g原药材）。各组小鼠分别灌胃相应药物，模型组给予等体积生理盐水（0.2 mL/10 g），连续10 d。末次给药后30 min腹腔注射0.6%冰醋酸生理盐水0.2 mL/只，计数15 min内小鼠扭体（腹部内凹，躯体与后腿伸张，臀部高起）次数。采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据均以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2.4 川续断皂苷Ⅵ含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：212 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算不低于3000[6]。
2.4.2 对照品溶液的制备 取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含川续断皂苷Ⅵ2.08 mg的溶液。 2.4.3 供试品溶液的制备 取提取物粉末约0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，溶解并定容至刻度，即得。
2.4.4 阴性对照溶液的制备 按该制剂处方制备不含续断的阴性样品，按“2.4.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.4.5 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，定容至1 mL容量瓶中，精密吸取上述系列溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=4×106X-343 365（r=0.999 9）。结果表明，川续断皂苷Ⅵ在4.16～41.6 μg范围内呈良好线性关系。
2.4.6 含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积积分值，按标准曲线计算，即得。
3 提取工艺优选结果
3.1 提取溶剂的筛选
扭体镇痛试验结果显示，散剂组、水提物组和醇提物组均可显著降低小鼠的扭体次数（P<0.05），具有镇痛作用。与散剂组比较，水提物组和醇提物组均可显著降低小鼠扭体次数（P<0.05）。结果见表1。但水提物组与醇提组之间无明显差异。考虑到规模生产时的生产成本和安全性，选择水作为本工艺的主要提取溶剂。
3.2 提取因素的筛选
提取工艺主要受溶剂种类、溶剂用量、提取时间和提取次数影响。取土鳖虫、续断、骨碎补等5味药材，按处方比例称取80 g，粉碎，用水提取。以出膏率、正丁醇浸出率、川续断皂苷Ⅵ含量为评价指标，以影响提取效果的溶剂用量、提取时间、提取次数为因素，每个因素取3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验，优选最佳提取工艺，因素水平见表2，试验结果见表3。
4 讨论
蟅虫创愈胶囊组方中龙骨等矿物药采用直接打粉入药，原因有以下几点：①龙骨等药材有效物质基础不确定，质地坚硬，口服有不适感，水提取其有效成分难以溶出，缺少相关的质量控制指标；②龙骨等药材粉碎加入后可改善提取物流动性，降低装量差异；③可减小制剂的吸湿性，有助于提高制剂稳定性。
该组方为中药复方，其成分组成极为复杂，查阅文献可知，有效成分既有水溶性成分又有脂溶性成分[7-9]，通过多成分多靶点起治疗作用，所以采用50%乙醇提取和水提取进行药理筛选。该方主要功效为消肿止痛，用于跌打损伤和闭合性骨折的急性发作期，故采用冰醋酸致小鼠扭体试验考察2种提取方法对止痛作用的影响。试验结果显示，50%乙醇提取物与水提取物作用相当，结合生产成本及安全考虑，采用水提。
川续断皂苷Ⅵ是该方臣药续断的有效成分之一，具有促进干细胞向骨细胞方向分化的作用[10]。选择川续断皂苷Ⅵ作为考察因素，既能有效控制提取工艺质量，又可在一定程度上保证药效。因此在水提工艺研究中，首先考察了药材的吸水量为183%，再通过正交试验以出膏率、正丁醇浸出物、川续断皂苷Ⅵ为评价指标进行综合评分。由此筛选出的提取工艺合理可行，适用于生产过程。
参考文献：
[1] 蒋金和，张云梅，王利勤，等.骨碎补属植物化学成分及生物活性研究进展[J].西北植物学报，2007，27（5）：1039-1046.
[2] 刘梅，王拥军，施杞，等.土鳖虫提取工艺研究[J].中华中医药学刊， 2010，28（8）：1657-1659.
[3] 张丹，颜学伟，王刚，等.正交试验优选盐炙续断炮制工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：27-29.
[4] 董玉琼，何晓红，钟国跃，等.正交法优选川续断的提取工艺[J].中国中药杂志，2007，32（11）：1107-1109.
[5] 陈刚，于兆海，于科亭.消肿止痛胶囊主要药效学研究[J].中国药房， 2009，20（12）：898-899.
[6] 吴旭彤，毛春芹，陆兔林，等.HPLC测定损伤复元颗粒中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].南京中医药大学学报，2011，27（6）：585-586.
[7] 刘剑刚，谢雁鸣，赵晋宁，等.骨碎补总黄酮胶囊对实验性骨质疏松症和镇痛作用的影响[J].中国实验方剂学杂志，2004，10（5）：31-34.
[8] 郎杰，郑玉光，陈连文，等.土鳖虫对大鼠抗凝血和促纤溶作用研究[J].中药药理与临床，2006，22（3）：108-109.
[9] 樊粤光，黄永明，曾意荣，等.骨碎补提取液对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用[J].中国中医骨伤科杂志，2003，11（6）：4-6.
[10] 武密山，赵素芝，任立中，等.川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究[J].中国药理学通报，2012，28（2）：222- 226.
（收稿日期：2013-09-22；编辑：陈静）
关键词：蟅虫创愈胶囊；正交试验；提取工艺
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.025
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0080-03
Abstract：Objective To establish the extraction process of Zhechong Chuangyu Capsule. Methods The difference of analgesic effect of water extraction and alcohol extraction in mice was observed by body-torsion test to determine the extract solvent. With the rate of aqueous extraction， n-butyl alcohol extraction and asperosaponin Ⅵ as evaluating indicator， the influencing factors including solvent volume， time and times of extraction were investegated to evaluate extracting procedure by orthogonal experiment. Results There was no obvious difference in analgesic effect between water extraction and alcohol extraction. Given the requirement of produce， aqueous extraction was a better choice. The optimum extracting condition was extracted 3 times with 20 folds volume of solvent， and extraction time was 150 minutes. Conclusion The extraction process is feasible to be applied into production.
Key words：Zhechong Chuangyu Capsule；orthogonal experiment；extraction process
蟅虫创愈胶囊组方为兰州市中医医院临床经验方，由土鳖虫、续断、骨碎补等8味药组成，一直以散剂形式应用于骨伤科临床，治疗急性发作期跌打损伤。但散剂粉末细碎、比表面积大，易吸潮结块，造成有效成分损失。且该散剂中含有龙骨、牡蛎矿石类药物，对胃肠具有一定刺激性，患者依从性差。为减小用量，提高疗效，将散剂改为胶囊剂。根据处方各药材性质，将龙骨等药材直接粉碎加入，将骨碎补等5味药材进行水提，利用正交试验设计安排试验，优选最佳提取工艺。
1 仪器、试药与动物
2 方法
2.1 出膏率测定
取土鳖虫、续断、骨碎补等5味药材，按处方比例称取80 g，粉碎，用水提取[1-4]。收集水提液，60 ℃以下减压浓缩至适宜体积，准确量取10 mL，共计2份。其中1份置于恒重的蒸发皿中，低温干燥至一定程度，105 ℃干燥至恒重，计算出膏率。
2.2 正丁醇浸出率测定
按“2.1”项下方法制得浸膏粉。取2 g浸膏粉加水20 mL溶解，加水饱和正丁醇萃取2次，20 mL/次。合并正丁醇层，置恒重蒸发皿中蒸干，干燥至恒重，计算其浸出率。
2.3 提取溶剂的筛选
通过扭体镇痛试验[5]初步观察原工艺、水提工艺和醇提工艺对该制剂药效的影响，从而确定提取溶剂。48只小鼠，适应性饲养1 d，按体质量随机分为模型组、散剂组、水提物组和醇提物组，每组12只。通过临床用药量折算，各组小鼠给药剂量分别为：散剂组0.617 g/kg（全草粉），水提物组0.345 g/kg（0.56 g药粉相当于1 g原药材），醇提物组0.314 g/kg（0.51 g药粉相当于1 g原药材）。各组小鼠分别灌胃相应药物，模型组给予等体积生理盐水（0.2 mL/10 g），连续10 d。末次给药后30 min腹腔注射0.6%冰醋酸生理盐水0.2 mL/只，计数15 min内小鼠扭体（腹部内凹，躯体与后腿伸张，臀部高起）次数。采用SPSS13.0统计软件进行分析，数据均以—x±s表示，组间比较采用t检验。P<0.05表示差异有统计学意义。
2.4 川续断皂苷Ⅵ含量测定
2.4.1 色谱条件 色谱柱：Waters symmetry C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水（30∶70）；流速：1.0 mL/min；检测波长：212 nm；柱温：30 ℃；进样量：20 μL。理论板数按川续断皂苷Ⅵ峰计算不低于3000[6]。
2.4.2 对照品溶液的制备 取川续断皂苷Ⅵ对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含川续断皂苷Ⅵ2.08 mg的溶液。 2.4.3 供试品溶液的制备 取提取物粉末约0.5 g，精密称定，置10 mL容量瓶中，加甲醇超声处理10 min，溶解并定容至刻度，即得。
2.4.4 阴性对照溶液的制备 按该制剂处方制备不含续断的阴性样品，按“2.4.3”项下方法制备阴性对照溶液。
2.4.5 标准曲线的制备 分别精密吸取“2.4.2”项下对照品溶液0.1、0.2、0.5、0.8、1 mL，定容至1 mL容量瓶中，精密吸取上述系列溶液各20 μL注入液相色谱仪，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，对照品进样量（μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到线性回归方程Y=4×106X-343 365（r=0.999 9）。结果表明，川续断皂苷Ⅵ在4.16～41.6 μg范围内呈良好线性关系。
2.4.6 含量测定 分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各20 μL，注入液相色谱仪，测定川续断皂苷Ⅵ色谱峰峰面积积分值，按标准曲线计算，即得。
3 提取工艺优选结果
3.1 提取溶剂的筛选
扭体镇痛试验结果显示，散剂组、水提物组和醇提物组均可显著降低小鼠的扭体次数（P<0.05），具有镇痛作用。与散剂组比较，水提物组和醇提物组均可显著降低小鼠扭体次数（P<0.05）。结果见表1。但水提物组与醇提组之间无明显差异。考虑到规模生产时的生产成本和安全性，选择水作为本工艺的主要提取溶剂。
3.2 提取因素的筛选
提取工艺主要受溶剂种类、溶剂用量、提取时间和提取次数影响。取土鳖虫、续断、骨碎补等5味药材，按处方比例称取80 g，粉碎，用水提取。以出膏率、正丁醇浸出率、川续断皂苷Ⅵ含量为评价指标，以影响提取效果的溶剂用量、提取时间、提取次数为因素，每个因素取3个水平，按L9（34）正交表进行正交试验，优选最佳提取工艺，因素水平见表2，试验结果见表3。
4 讨论
蟅虫创愈胶囊组方中龙骨等矿物药采用直接打粉入药，原因有以下几点：①龙骨等药材有效物质基础不确定，质地坚硬，口服有不适感，水提取其有效成分难以溶出，缺少相关的质量控制指标；②龙骨等药材粉碎加入后可改善提取物流动性，降低装量差异；③可减小制剂的吸湿性，有助于提高制剂稳定性。
该组方为中药复方，其成分组成极为复杂，查阅文献可知，有效成分既有水溶性成分又有脂溶性成分[7-9]，通过多成分多靶点起治疗作用，所以采用50%乙醇提取和水提取进行药理筛选。该方主要功效为消肿止痛，用于跌打损伤和闭合性骨折的急性发作期，故采用冰醋酸致小鼠扭体试验考察2种提取方法对止痛作用的影响。试验结果显示，50%乙醇提取物与水提取物作用相当，结合生产成本及安全考虑，采用水提。
川续断皂苷Ⅵ是该方臣药续断的有效成分之一，具有促进干细胞向骨细胞方向分化的作用[10]。选择川续断皂苷Ⅵ作为考察因素，既能有效控制提取工艺质量，又可在一定程度上保证药效。因此在水提工艺研究中，首先考察了药材的吸水量为183%，再通过正交试验以出膏率、正丁醇浸出物、川续断皂苷Ⅵ为评价指标进行综合评分。由此筛选出的提取工艺合理可行，适用于生产过程。
参考文献：
[1] 蒋金和，张云梅，王利勤，等.骨碎补属植物化学成分及生物活性研究进展[J].西北植物学报，2007，27（5）：1039-1046.
[2] 刘梅，王拥军，施杞，等.土鳖虫提取工艺研究[J].中华中医药学刊， 2010，28（8）：1657-1659.
[3] 张丹，颜学伟，王刚，等.正交试验优选盐炙续断炮制工艺[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（7）：27-29.
[4] 董玉琼，何晓红，钟国跃，等.正交法优选川续断的提取工艺[J].中国中药杂志，2007，32（11）：1107-1109.
[5] 陈刚，于兆海，于科亭.消肿止痛胶囊主要药效学研究[J].中国药房， 2009，20（12）：898-899.
[6] 吴旭彤，毛春芹，陆兔林，等.HPLC测定损伤复元颗粒中川续断皂苷Ⅵ的含量[J].南京中医药大学学报，2011，27（6）：585-586.
[7] 刘剑刚，谢雁鸣，赵晋宁，等.骨碎补总黄酮胶囊对实验性骨质疏松症和镇痛作用的影响[J].中国实验方剂学杂志，2004，10（5）：31-34.
[8] 郎杰，郑玉光，陈连文，等.土鳖虫对大鼠抗凝血和促纤溶作用研究[J].中药药理与临床，2006，22（3）：108-109.
[9] 樊粤光，黄永明，曾意荣，等.骨碎补提取液对体外分离破骨细胞性骨吸收的作用[J].中国中医骨伤科杂志，2003，11（6）：4-6.
[10] 武密山，赵素芝，任立中，等.川续断皂苷Ⅵ诱导大鼠骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化的研究[J].中国药理学通报，2012，28（2）：222- 226.
（收稿日期：2013-09-22；编辑：陈静）