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摘要：目的 观察补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血损伤血脑屏障的保护作用，阐明该方抗脑缺血的机理。方法 采用线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型。将SD大鼠随机分为假手术组、模型组和补阳还五汤组，造模后24 h给药，补阳还五汤组给予补阳还五汤灌胃，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃。造模后7 d，评价各组大鼠神经功能并处死取材，四氮唑红染色观察大鼠脑组织梗死体积，HE染色观察大鼠脑微血管的一般形态，ELISA检测大鼠脑组织内基质金属蛋白酶（MMP）-9、MMP-2、血管内皮生长因子（VEGF）蛋白水平及血清中血管性血友病因子（vWF）的表达。结果 与模型组比较，补阳还五汤组能显著改善神经功能行为评分，减少脑梗死体积，降低MMP-9、MMP-2、VEGF、vWF水平。病理观察结果显示，补阳还五汤组脑组织病理变化较模型组减轻。结论 补阳还五汤对大鼠局灶性脑缺血具有保护作用，其作用可能与保护血脑屏障，抑制MMP-9、MMP-2、VEGF、vWF的表达有关。
关键词：补阳还五汤；局灶性脑缺血；血脑屏障；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；血管内皮生长因子；血管性血友病因子；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0049-04
Abstract：Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on blood-brain barrier of focal cerebral ischemia rats， and explore the mechanism of the decoction. Methods The model of focal cerebral ischemia was made by thread embolism method. SD rats were divided randomly into sham-operated group， model group and Buyang Huanwu Decoction group. Buyang Huanwu Decoction group was given Buyang Huanwu Decoction by gavage， the sham-operated group and model group were given normal saline of the same quantity 24 h after modeling. The nervous function deficit scores was evaluated， brain tissues and serum were taken from the rats after treating for seven days， infarct volume was detected by TTC staining， and pathological changes of microvessel were observed microscopically in HE stained sections. And the protein level of MMP-9， MMP-2， VEGF in brain tissue and the serum levels of vWF in serum of every groups were measured by ELISA. Results Compared with model group， Buyang Huanwu Decoction significantly improved the neurological behavior performance， decreased the cerebral infarct volume， alleviated the pathological changes and decreased the protein level of MMP-9， MMP-2， VEGF， vWF. Conclusion Buyang Huanwu Decoction has the protective effect on blood-brain barrier in the model rats of focal cerebral ischemia. The mechanism may be related with restrainning the expression of MMP-9， MMP-2， VEGF， vWF.
Key words：Buyang Huanwu Decoction；focal cerebral ischemia；blood-brain barrier；MMP-2；MMP-9；VEGF；von Willebrand factor；rats
脑血管疾病是当前导致人类死亡和残障的主要原因之一，其中80%左右为缺血性脑血管疾病，且有逐年上升和年轻化的趋势。补阳还五汤为清代名医王清任所创的中医经典方剂，原方载于《医林改错·下卷·瘫痿论》，是治疗半身不遂、瘫痿不用诸症的首选方。前期研究表明，补阳还五汤可扩张脑血管、改善脑循环、对抗脑缺血后兴奋性氨基酸的毒性等[1]。本实验采用大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）模型，观察补阳还五汤对血清中血管性血友病因子（vWF）及脑组织中血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表达的影响，进一步阐述该方抗脑缺血的机理。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SPF级SD大鼠64只，12周龄，体质量（280±20）g，购于中国人民解放军军事医学科学院动物中心，许可证号：SCXK（军）2004-2009。 1.2 药物与试剂
补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、川芎3 g、地龙3 g、赤芍5 g、红花3 g、桃仁3 g组成，北京大学医学院提供，经水煎、浓缩制成1 g原药材/mL的溶液；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）：美国（aMResco公司，批号0765）。大鼠MMP-2、MMP-9、VEGF、vWF ELISA试剂盒：美国RB公司，规格96T，购于北京尚柏试剂有限公司（批号分别为63120912、28120811、27121009、52121203）。
1.3 主要仪器
电子分析天平（AE160型，瑞士Mettler公司），手术显微镜（SXP-1B，上海医用光学仪器厂），1411型高频小电刀（上海医疗器械技术公司），低温高速离心机（Sigma公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司），切片扫描仪（蔡司光学仪器有限公司），显微图像分析系统（日本尼康公司）。
2 实验方法
2.1 造模
根据Longa等[2]报道的线栓法建立大鼠永久性脑缺血模型。10%水合氯醛溶液（0.35 mg/kg体质量）腹腔注射麻醉后将大鼠仰位固定，常规碘酒、酒精消毒颈部皮肤。颈部正中作约2.5 cm切口，暴露左侧颈动脉三角，在手术显微镜下逐层分离组织，剥离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。电刀凝闭ECA的分支甲状腺动脉、ECA与ICA之间的枕动脉，结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉（PPA），用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA和PPA，用虹膜剪在ECA残端剪一楔形小口，由此插入钓鱼线（直径0.25 mm，头端呈直径约0.3 mm的圆球形），轻推钓鱼线使之由ECA通过分叉部进入ICA，至大脑中动脉的起点，阻断大脑中动脉的血液供应。尼龙线插入深度由分叉处计算约18～22 mm。缝合颈部切口，假手术组手术过程与模型组相同，分离出左侧CCA及ECA、ICA，仅结扎ECA。用缝合线结扎ECA残端，剪断多余栓线，术区使用青霉素粉少许，逐层缝合手术切口。待清醒后，参照Bedersont等[3]的评分方法，>3分者为造模成功。假手术组手术过程与模型组相同，但只结扎ECA远心端，不插入栓线阻塞血管。
2.2 分组与给药
将造模成功的大鼠按照神经功能评分均匀分组，分为模型组和补阳还五汤组。补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤水煎液，给药剂量为1.26 g原药材/100 g体质量（相当于临床成人日用量的6.3倍），造模后24 h立即灌胃，之后每日称大鼠体质量，计算给药量，于相同时间点给药1次；假手术组和模型组给予等量生理盐水。连续给药6 d，第7日进行神经功能评分并处死取材。
2.3 检测方法及观察指标
2.3.1 神经功能评分 参考Bederson等[3]方法，总分10分。①提鼠尾，观察右前肢表现。1分：内收，但不贴身；2分：内收，贴于身体；3分：内收贴于身体并踡缩；4分：大鼠躯体向右侧旋转。②评价两前肢肌张力：将动物置于一金属网上，向后轻提鼠尾，观察两侧前肢肌张力。0分：两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差别者；1分：右前肢拉金属网但肌力明显弱于左侧；2分：右前肢不能拉金属网。③将动物置一光滑平面，观察侧向推挡阻力。0分：双侧推挡阻力无明显差别；1分：右侧推挡阻力明显弱于左侧；2分：右推大鼠时其向右侧倾倒。④大鼠左眼上睑下垂，左眼分泌物增多者评2分。以上4项评分相加为最后神经功能评分。
2.3.2 大鼠脑梗死体积检测 造模后第7日，将麻醉大鼠断头取全脑后迅速放于-20 ℃冰箱中冻存15 min后，距额极2 mm开始，以视交叉水平为中心，间隔2 mm做连续冠状切片，每个脑块切5片，迅速投入5 mL 1%TTC溶液中，置37 ℃孵箱孵育30 min，避光。正常脑组织染成红色，缺血区呈灰白色。TTC染色均匀后取出脑组织，放置于盛有4%多聚甲醛液的小瓶内，固定24 h，取出后滤纸吸干表面水分，用扫描仪扫出图片，计算梗死体积占大脑半球体积的百分比。
2.3.3 大鼠脑组织及微血管的形态观察 造模后第7日，大鼠灌注后断头取脑，置于4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液（pH 7.2～7.6）固定24 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，于视交叉前缘开始作5 μm厚冠状切片。常规脱蜡水化，行HE染色，中性树胶封片。光镜下观察脑组织及微血管形态学改变。
2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的含量测定 造模后第7日，将动物麻醉，自腹主动脉采血，静置30 min后离心取上清冻存备用。再取脑分离出左侧（患侧）半球放于冻存管置液氮中，检测前以生理盐水制成10%脑组织匀浆。取制备好的血清及脑组织匀浆，按照试剂盒说明操作。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验结果均以—x±s表示，数据资料经正态性分布检验及方差齐性检验后，采用方差或非参数检验比较组间差异。P<0.05表示差异有统计意义。
4 结果
4.1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响
动物苏醒后，模型组和补阳还五汤组都存在明显神经功能缺损，神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）；假手术组未见神经功能缺损。灌胃6 d后，模型组神经功能评分略增高，但前后比较差异无统计学意义（P>0.05）；补阳还五汤组神经功能评分显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），提示补阳还五汤能够促进大鼠的神经功能恢复，减轻缺损程度。各组大鼠神经功能评分见表1。
5 讨论
现代研究表明，补阳还五汤可增强微血管应激能力，缓解微血管痉挛，减轻其损伤程度，使微血管密度及微血管面积比增加，减轻缺血损伤[4]。本实验结果表明，给永久性脑缺血动物补阳还五汤后，神经功能缺损明显改善，脑梗死体积显著减小。 血脑屏障破坏可导致血管源性脑水肿和脑疝的发生，造成病情的恶化。故减轻缺血对血脑屏障造成的损伤，保护脑组织，成为治疗的一个重要靶点。脑组织中细胞外基质（ECM）是维持血脑屏障结构完整性的重要组成部分，而MMPs激活后能够降解ECM成分。MMPs是一组Zn2+、Ca2+依赖性的蛋白水解酶，正常时以酶原形式存在，在一些生理和病理条件下被激活，参与组织的损伤和修复。在脑缺血损伤中起重要作用的是MMP-2和MMP-9，可降解ECM、破坏脑血管外基底膜主要成分，从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源性脑水肿甚至出血性转化，还可使炎性细胞浸润至脑组织，引发一系列炎症反应。脑缺血后MMP-2表达增加与早期神经元的损伤有关，MMP-9表达增加与脑梗死后出血转化有关。MMP-9水平的上升出现在缺血性脑卒中早期或急性期，导致血脑屏障的破坏，进一步促使神经炎症反应和神经细胞的继发性死亡。Higashida J等[5]研究发现，通过提高缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、水通道蛋白4（AQP4）、MMP-9的表达可以降低血管基底膜蛋白表达和紧密连接蛋白的表达，加重脑水肿，通过抑制HIF-1α、MMP-9的表达，降低血脑屏障的通透性，但不受AQP4的影响。Romanic等[6]则发现应用MMP-9单克隆抗体，梗死灶缩小了29.9%。因此我们推测，早期选择性抑制MMP-2、MMP-9可显著减轻脑梗死[7-8]。
本实验采用酶联免疫法检测了脑组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达情况，在假手术组仅有少量表达，与文献报道基本一致[9-10]，脑缺血后MMP-2、MMP-9蛋白表达量显著增加，应用补阳还五汤干预后，二者水平均显著下降，提示补阳还五汤可以通过抑制MMP-2、MMP-9表达，保护血脑屏障，减轻脑损伤。
内皮细胞是构成血脑屏障的主要物质基础。循环中的vWF主要来自血管内皮细胞，内皮细胞受损则合成和释放vWF增加，内皮细胞损伤越严重，则血浆中vWF水平越高。vWF可加速血小板黏附、聚集，介导血小板释放相关因子，干扰纤溶过程，促进血管平滑纤维化、动脉粥样斑块及血栓形成，且与疾病的轻重呈正相关。因此，vWF被认为是心血管疾病的一个高危因素，并被作为血管内皮细胞损害的标志物。本实验脑缺血后大鼠血清中vWF表达增高，补阳还五汤显著减少了其表达，说明补阳还五汤可以保护内皮细胞，从而维持血脑屏障结构的完整性。
VEGF是另一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子，是内皮细胞特异性的促有丝分裂源，能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移，它在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用，是目前公认的血管新生中最关键的因子。本实验假手术组VEGF有少量表达，模型组VEGF表达量增高，这可能是缺血性脑损伤诱导VEGF基因早期表达的缘故；应用补阳还五汤干预后，VEGF显著降低，笔者认为，这可能和VEGF的动态表达有关。因此，可以推测，补阳还五汤可通过多环节调节VEGF，保护血脑屏障。
目前，西医治疗脑缺血及其后遗症尚无突破性进展，而中医药防治脑缺血具有很大潜力。本实验显示，补阳还五汤能改善神经功能缺损，减少脑梗死体积，其发挥作用的机理可能是通过抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表达而保护血脑屏障，也可能是通过调控VEGF、vWF等内皮活性因子，改善微循环，促进脑血流的恢复。
参考文献：
[1] 邓常青，邓奕晖，贺福元，等.补阳还五汤和有效部位组方对沙土鼠脑缺血及再灌注后脑组织EAA的影响[J].中国实验方剂学杂志，2001，7（6）：24- 27.
[2] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reverible middle cerebral artery occlusion without cranjectomy in rats[J]. Stroke， 1989，20（1）：84-91.
[3] Bederson JB， Pitts LH， Tsuji M， et al. Rats middle cerebral artery occlusion evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17（3）：472-476.
[4] Wu XG， Liu YX， Liu HX， et al. Microvessel changes in the gerbil hippocampus after cerebral ischemia and reperfusion by Buyang Huanwu decoction pretreatment[J]. Neral Regeneration Research， 2011，6（9）：656-660.
[5] Higashida T， K reipke CW， Rafols JA， et al. The role of hypoxia- inducible factor-1 alpha， aquaporin-4， and matrix metalloproteinase- 9 in blood-brain barrier disruption and brain edema after traumatic brain injury[J]. J Neurosurg，2011，114（1）：92-101.
[6] Romanic AM， White RF， Arleth AJ， et al. Matrix metalloproteinase expression increase after cerebral focal ischemia in rat：inhibition of matrix metalloproteinase-9 reduces infarct size[J]. Stroke，1998，29（5）：1020-1030.
[7] Kamada H， Yu F， Nito C， et al. Influence of hyperglycemia on oxidative stress and matrix metalloproteinase-9 activation after focal cerebral ischemia/reperfusion in rats：relation to blood brain barrier dysfunction[J]. Stroke，2007，38（3）：1044-1049.
[8] Maier CM， Hsieh L， Yu F， et al. Matrix metalloproteinase-9 and myeloperoxidase expression：quantitative analysis by antigen immunohistochemistry in a model of transient focal cerebral ischemia[J]. Stroke，2004，35（5）：1169-1174.
[9] Yang GY， Lorrisbetz A. Reperfusion-induced injury to the blood barrier after middle cerebral artery occlusion in rats[J]. Stroke，1994，25（8）：1658-1663.
[10] Cuzner ML， Strand C. The expression of tissue-type plasminogen activator， matrix metalloproteinases and endogenous inhibitors in the central nervous system in multiple sclerosis[J]. J Neuopathol Exp Neurol，1996，55（12）：1194-1204.
（收稿日期：2014-01-12；编辑：华强）
关键词：补阳还五汤；局灶性脑缺血；血脑屏障；基质金属蛋白酶-2；基质金属蛋白酶-9；血管内皮生长因子；血管性血友病因子；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.06.017
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）06-0049-04
Abstract：Objective To investigate the effect of Buyang Huanwu Decoction on blood-brain barrier of focal cerebral ischemia rats， and explore the mechanism of the decoction. Methods The model of focal cerebral ischemia was made by thread embolism method. SD rats were divided randomly into sham-operated group， model group and Buyang Huanwu Decoction group. Buyang Huanwu Decoction group was given Buyang Huanwu Decoction by gavage， the sham-operated group and model group were given normal saline of the same quantity 24 h after modeling. The nervous function deficit scores was evaluated， brain tissues and serum were taken from the rats after treating for seven days， infarct volume was detected by TTC staining， and pathological changes of microvessel were observed microscopically in HE stained sections. And the protein level of MMP-9， MMP-2， VEGF in brain tissue and the serum levels of vWF in serum of every groups were measured by ELISA. Results Compared with model group， Buyang Huanwu Decoction significantly improved the neurological behavior performance， decreased the cerebral infarct volume， alleviated the pathological changes and decreased the protein level of MMP-9， MMP-2， VEGF， vWF. Conclusion Buyang Huanwu Decoction has the protective effect on blood-brain barrier in the model rats of focal cerebral ischemia. The mechanism may be related with restrainning the expression of MMP-9， MMP-2， VEGF， vWF.
Key words：Buyang Huanwu Decoction；focal cerebral ischemia；blood-brain barrier；MMP-2；MMP-9；VEGF；von Willebrand factor；rats
脑血管疾病是当前导致人类死亡和残障的主要原因之一，其中80%左右为缺血性脑血管疾病，且有逐年上升和年轻化的趋势。补阳还五汤为清代名医王清任所创的中医经典方剂，原方载于《医林改错·下卷·瘫痿论》，是治疗半身不遂、瘫痿不用诸症的首选方。前期研究表明，补阳还五汤可扩张脑血管、改善脑循环、对抗脑缺血后兴奋性氨基酸的毒性等[1]。本实验采用大鼠大脑中动脉阻断（MCAO）模型，观察补阳还五汤对血清中血管性血友病因子（vWF）及脑组织中血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMP）-2、MMP-9表达的影响，进一步阐述该方抗脑缺血的机理。
1 实验材料
1.1 动物
健康雄性SPF级SD大鼠64只，12周龄，体质量（280±20）g，购于中国人民解放军军事医学科学院动物中心，许可证号：SCXK（军）2004-2009。 1.2 药物与试剂
补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、川芎3 g、地龙3 g、赤芍5 g、红花3 g、桃仁3 g组成，北京大学医学院提供，经水煎、浓缩制成1 g原药材/mL的溶液；2，3，5-三苯基氯化四氮唑（TTC）：美国（aMResco公司，批号0765）。大鼠MMP-2、MMP-9、VEGF、vWF ELISA试剂盒：美国RB公司，规格96T，购于北京尚柏试剂有限公司（批号分别为63120912、28120811、27121009、52121203）。
1.3 主要仪器
电子分析天平（AE160型，瑞士Mettler公司），手术显微镜（SXP-1B，上海医用光学仪器厂），1411型高频小电刀（上海医疗器械技术公司），低温高速离心机（Sigma公司），光学显微镜（日本OLYMPUS公司），切片扫描仪（蔡司光学仪器有限公司），显微图像分析系统（日本尼康公司）。
2 实验方法
2.1 造模
根据Longa等[2]报道的线栓法建立大鼠永久性脑缺血模型。10%水合氯醛溶液（0.35 mg/kg体质量）腹腔注射麻醉后将大鼠仰位固定，常规碘酒、酒精消毒颈部皮肤。颈部正中作约2.5 cm切口，暴露左侧颈动脉三角，在手术显微镜下逐层分离组织，剥离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。电刀凝闭ECA的分支甲状腺动脉、ECA与ICA之间的枕动脉，结扎游离ECA主干，分离ICA主干至翼腭动脉（PPA），用无损动脉夹分别夹闭CCA、ICA和PPA，用虹膜剪在ECA残端剪一楔形小口，由此插入钓鱼线（直径0.25 mm，头端呈直径约0.3 mm的圆球形），轻推钓鱼线使之由ECA通过分叉部进入ICA，至大脑中动脉的起点，阻断大脑中动脉的血液供应。尼龙线插入深度由分叉处计算约18～22 mm。缝合颈部切口，假手术组手术过程与模型组相同，分离出左侧CCA及ECA、ICA，仅结扎ECA。用缝合线结扎ECA残端，剪断多余栓线，术区使用青霉素粉少许，逐层缝合手术切口。待清醒后，参照Bedersont等[3]的评分方法，>3分者为造模成功。假手术组手术过程与模型组相同，但只结扎ECA远心端，不插入栓线阻塞血管。
2.2 分组与给药
将造模成功的大鼠按照神经功能评分均匀分组，分为模型组和补阳还五汤组。补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤水煎液，给药剂量为1.26 g原药材/100 g体质量（相当于临床成人日用量的6.3倍），造模后24 h立即灌胃，之后每日称大鼠体质量，计算给药量，于相同时间点给药1次；假手术组和模型组给予等量生理盐水。连续给药6 d，第7日进行神经功能评分并处死取材。
2.3 检测方法及观察指标
2.3.1 神经功能评分 参考Bederson等[3]方法，总分10分。①提鼠尾，观察右前肢表现。1分：内收，但不贴身；2分：内收，贴于身体；3分：内收贴于身体并踡缩；4分：大鼠躯体向右侧旋转。②评价两前肢肌张力：将动物置于一金属网上，向后轻提鼠尾，观察两侧前肢肌张力。0分：两侧前肢紧拉金属网肌力无明显差别者；1分：右前肢拉金属网但肌力明显弱于左侧；2分：右前肢不能拉金属网。③将动物置一光滑平面，观察侧向推挡阻力。0分：双侧推挡阻力无明显差别；1分：右侧推挡阻力明显弱于左侧；2分：右推大鼠时其向右侧倾倒。④大鼠左眼上睑下垂，左眼分泌物增多者评2分。以上4项评分相加为最后神经功能评分。
2.3.2 大鼠脑梗死体积检测 造模后第7日，将麻醉大鼠断头取全脑后迅速放于-20 ℃冰箱中冻存15 min后，距额极2 mm开始，以视交叉水平为中心，间隔2 mm做连续冠状切片，每个脑块切5片，迅速投入5 mL 1%TTC溶液中，置37 ℃孵箱孵育30 min，避光。正常脑组织染成红色，缺血区呈灰白色。TTC染色均匀后取出脑组织，放置于盛有4%多聚甲醛液的小瓶内，固定24 h，取出后滤纸吸干表面水分，用扫描仪扫出图片，计算梗死体积占大脑半球体积的百分比。
2.3.3 大鼠脑组织及微血管的形态观察 造模后第7日，大鼠灌注后断头取脑，置于4 ℃、4%中性多聚甲醛固定液（pH 7.2～7.6）固定24 h后，常规脱水、透明、浸蜡、包埋，于视交叉前缘开始作5 μm厚冠状切片。常规脱蜡水化，行HE染色，中性树胶封片。光镜下观察脑组织及微血管形态学改变。
2.3.4 大鼠血清中血管性血友病因子及脑组织中基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9、血管内皮生长因子的含量测定 造模后第7日，将动物麻醉，自腹主动脉采血，静置30 min后离心取上清冻存备用。再取脑分离出左侧（患侧）半球放于冻存管置液氮中，检测前以生理盐水制成10%脑组织匀浆。取制备好的血清及脑组织匀浆，按照试剂盒说明操作。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验结果均以—x±s表示，数据资料经正态性分布检验及方差齐性检验后，采用方差或非参数检验比较组间差异。P<0.05表示差异有统计意义。
4 结果
4.1 补阳还五汤对大鼠神经功能评分的影响
动物苏醒后，模型组和补阳还五汤组都存在明显神经功能缺损，神经功能评分差异无统计学意义（P>0.05）；假手术组未见神经功能缺损。灌胃6 d后，模型组神经功能评分略增高，但前后比较差异无统计学意义（P>0.05）；补阳还五汤组神经功能评分显著降低，与模型组比较差异有统计学意义（P<0.01），提示补阳还五汤能够促进大鼠的神经功能恢复，减轻缺损程度。各组大鼠神经功能评分见表1。
5 讨论
现代研究表明，补阳还五汤可增强微血管应激能力，缓解微血管痉挛，减轻其损伤程度，使微血管密度及微血管面积比增加，减轻缺血损伤[4]。本实验结果表明，给永久性脑缺血动物补阳还五汤后，神经功能缺损明显改善，脑梗死体积显著减小。 血脑屏障破坏可导致血管源性脑水肿和脑疝的发生，造成病情的恶化。故减轻缺血对血脑屏障造成的损伤，保护脑组织，成为治疗的一个重要靶点。脑组织中细胞外基质（ECM）是维持血脑屏障结构完整性的重要组成部分，而MMPs激活后能够降解ECM成分。MMPs是一组Zn2+、Ca2+依赖性的蛋白水解酶，正常时以酶原形式存在，在一些生理和病理条件下被激活，参与组织的损伤和修复。在脑缺血损伤中起重要作用的是MMP-2和MMP-9，可降解ECM、破坏脑血管外基底膜主要成分，从而破坏血脑屏障、改变毛细血管通透性导致血管源性脑水肿甚至出血性转化，还可使炎性细胞浸润至脑组织，引发一系列炎症反应。脑缺血后MMP-2表达增加与早期神经元的损伤有关，MMP-9表达增加与脑梗死后出血转化有关。MMP-9水平的上升出现在缺血性脑卒中早期或急性期，导致血脑屏障的破坏，进一步促使神经炎症反应和神经细胞的继发性死亡。Higashida J等[5]研究发现，通过提高缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）、水通道蛋白4（AQP4）、MMP-9的表达可以降低血管基底膜蛋白表达和紧密连接蛋白的表达，加重脑水肿，通过抑制HIF-1α、MMP-9的表达，降低血脑屏障的通透性，但不受AQP4的影响。Romanic等[6]则发现应用MMP-9单克隆抗体，梗死灶缩小了29.9%。因此我们推测，早期选择性抑制MMP-2、MMP-9可显著减轻脑梗死[7-8]。
本实验采用酶联免疫法检测了脑组织中MMP-2、MMP-9蛋白表达情况，在假手术组仅有少量表达，与文献报道基本一致[9-10]，脑缺血后MMP-2、MMP-9蛋白表达量显著增加，应用补阳还五汤干预后，二者水平均显著下降，提示补阳还五汤可以通过抑制MMP-2、MMP-9表达，保护血脑屏障，减轻脑损伤。
内皮细胞是构成血脑屏障的主要物质基础。循环中的vWF主要来自血管内皮细胞，内皮细胞受损则合成和释放vWF增加，内皮细胞损伤越严重，则血浆中vWF水平越高。vWF可加速血小板黏附、聚集，介导血小板释放相关因子，干扰纤溶过程，促进血管平滑纤维化、动脉粥样斑块及血栓形成，且与疾病的轻重呈正相关。因此，vWF被认为是心血管疾病的一个高危因素，并被作为血管内皮细胞损害的标志物。本实验脑缺血后大鼠血清中vWF表达增高，补阳还五汤显著减少了其表达，说明补阳还五汤可以保护内皮细胞，从而维持血脑屏障结构的完整性。
VEGF是另一种特异性作用于血管内皮细胞的多功能因子，是内皮细胞特异性的促有丝分裂源，能促进内皮细胞分裂、增殖增生和转移，它在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用，是目前公认的血管新生中最关键的因子。本实验假手术组VEGF有少量表达，模型组VEGF表达量增高，这可能是缺血性脑损伤诱导VEGF基因早期表达的缘故；应用补阳还五汤干预后，VEGF显著降低，笔者认为，这可能和VEGF的动态表达有关。因此，可以推测，补阳还五汤可通过多环节调节VEGF，保护血脑屏障。
目前，西医治疗脑缺血及其后遗症尚无突破性进展，而中医药防治脑缺血具有很大潜力。本实验显示，补阳还五汤能改善神经功能缺损，减少脑梗死体积，其发挥作用的机理可能是通过抑制MMP-9、MMP-2、vWF的表达而保护血脑屏障，也可能是通过调控VEGF、vWF等内皮活性因子，改善微循环，促进脑血流的恢复。
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（收稿日期：2014-01-12；编辑：华强）