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[摘要]目的：研究大孔树脂分离和富集麦冬中总皂苷的工艺条件。方法：以麦冬中含量较高的麦冬皂苷A和麦冬皂苷B的富集量作为考察指标来确定富集效果。对5种不同类型的树脂进行评价优选。结果：D一101型大孔吸附树脂对麦冬中总皂苷有较好的分离富集能力。通过D一101大孔吸附树脂富集，麦冬提取物可以有效除去糖类等水溶性杂质，使麦冬皂苷A含量提高32倍，使麦冬皂苷B的含量提高36倍，富集效果好。
[关键词]麦冬 大孔吸附树脂 总皂甙
中图分类号：O6-0 文献标识码：A 文章编号：1671－7597（2008）1220002－02
麦冬（Radix Ophiopogonis）为百合科植物沿阶草冬，以块根入药。味甘、微苦，性凉、滋阴生津、润肺止咳、清心除烦。
麦冬中含有麦冬皂甙有抗心律失常作用，对缺血性老损伤有保护作用，对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤有保护作用[1]。麦冬中皂甙越来越受到广泛的关注。大孔吸附树脂为一种选择性的有机高聚吸附剂，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点[2]。大孔吸附树脂现已被广泛应用于天然产物的分离和富集，但在麦冬中总皂甙富集纯化等方面的研究报道还不多。本文通过对5种不同类型的大孔吸附树脂的优选，旨在讨论D-101大孔吸附树脂对麦冬中总皂甙的纯化富集工艺参数，而对工业大生产提供数据参考支持。
一、仪器与材料
（一）仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；星海旋转蒸发器（无锡市星海王生生化设备有限公司）。玻璃填充柱（Ø2.2cm×8.5cm）；电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；JAC-150超声波清洗仪（山东济宁奥波超声电器有限公司）。
（二）药材及试剂
HPD100大孔树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）；D101大孔树脂（上海摩述公司）；XDA-1B大孔树脂（北京惠德易科技有限公司）；D001大孔换树脂（安徽三星树脂公司）；D311大孔树脂（蚌埠市辽源新材料有限公司）。麦冬皂苷A（AR，四川维科奇生物有限公司）；麦冬皂苷B（AR，上海海灿生物科技有限公司）；乙醇、乙氰，AR级；水（二次蒸馏，临用前自制）。
二、方法与结果
（一）麦冬皂苷A和麦冬皂苷B总皂苷含量的测定
1．HPLC色谱条件色谱柱：Cosmosil-C18（4.6mm×250mm，5um）；流动相：水乙腈（80:20）；检测波长：213nm；柱温：30℃；流速为1.0mL／min；进样量，10uL。
2．对照品溶液的制备精密称取麦冬皂苷A对照品1.02mg，麦冬皂苷B对照品0.202mg，用甲醇溶解定容至2mL，备用。
3．供试液的制备称取适量的麦冬用10倍乙醇超声提取30min3次，过滤，合并滤液后浓缩，挥干溶剂成浸膏。浸膏加水溶解制成提取液，加水定容至浓度为1.00g／mL作上样液，上大孔树脂，收集过大孔树脂的残留液、水洗脱液与不同浓度的乙醇洗脱液。将提取液、上样液、残留液和各洗脱液浓缩、挥去溶剂，用甲醇定容后作供试液。
（二）大孔树脂富集麦冬总皂苷工艺的单因素考察
1．大孔树脂预处理及装柱大孔树脂用95％乙醇浸泡24h，漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒，大孔树脂用抽滤瓶抽干乙醇后，加乙醇湿法上柱，并测定柱体积，再用乙醇洗脱至流出液加水不变混浊为止（乙醇：水=1:3），再用水洗脱至无醇味，备用。实验室配制标准试液（麦冬皂苷A：麦冬皂苷B=5:1）备用[3]。
2．静态吸附试验
精确称取HPD100大孔树脂，D-101大孔树脂，XDA-1B大孔树脂，D001 大孔换树脂，D311大孔树脂五种大孔吸附树脂脂各2g，置于100 mL的具磨口的锥形瓶中，加入50 mL的自制标准皂苷试液，吸附完全后的试液呈皂苷阳性反应；于室温下静态吸附24h，充分吸附后过滤，测定剩余溶液中总皂甙的浓度，按下式计算各树脂对总生物碱的吸附容量（mg·g-1干树脂）
Q=（C。－C）V/W
式中Q为吸附量（mg·g），C。为初始浓度（mg·mL），C为剩余质量浓度（mg·mL），V为溶液体积（mL），W为树脂质量（g）。结果见表1。
从表1中可以清楚地看出非极性的D101和HPD100树脂吸附容量较大，而相应的D001、D311及XDA-1B的吸附容量要小一些。
3．动态吸附实验
精密称取D101树脂5g，将预处理好的树脂装入玻璃色谱柱中，将自制标准溶液上柱，控制一定的流速（3BV／h），待流出液呈皂苷阳性反应时，停止上样，上样量为98mL计算吸附量：Q=（C0－C）V/W。结果显示D101树脂对麦冬中的总皂苷动吸附量最大，达22.6mg·g-1，吸附率高达96.1%而HPD100动态吸附容量为18.4mg·g-1，远小于D101的吸附容量。因此选择D101大孔吸附树脂进行进一步的动态解吸附实验。
（1）动态解吸附试验
① 蒸馏水用量的确定
取5根处理过的大孔吸附树脂柱（每根柱装5g树脂），进样量平均约为60mL，先用蒸馏水洗脱，用量分别为30mL，40mL，50mL，60mL，70mL，然后进行糖类鉴定，直到洗脱液Molish反应呈阴性为止[4]．用50mL蒸馏水洗脱时，洗脱液就呈阴性反应。故用50mL蒸馏水洗脱完全可以洗去糖类的杂质成分。
② 乙醇浓度的选择
将已吸附好样品的D101树脂先用50mL水洗脱，再用10％，30％，50％，70％，90％乙醇溶液各200mL进行解吸，流速控制2BV·h-1，接取流份，计算解吸率。结果解吸率分别为4.59％，58.36％，96.75％，97.22％，98.32％。可见解吸率随乙醇浓度的增加而增大，10％，30％乙醇解吸率很低，50％乙醇即可将大部分总皂苷的解吸，但乙醇浓度超过50％以后，解吸率有增加但很小，考虑到工业大生产中的成本因素，所以选择浓度为50%的乙醇作为洗脱剂。
③ 洗脱剂用量的确定
取5份预处理好的上述大孔吸附树脂各5g装柱（Ø2.2cm×8.5cm），加入自制标准试液。先用水洗50mL（约2BV），再用上述50％的乙醇溶液依次洗脱3BV、5BV、7BV、9BV、11BV，合并各洗脱液经浓缩定容后测定总皂苷含量，其测定结果见表2。
试验表明用50%的乙醇7BV的量洗脱，对两种皂苷的洗脱率高达96%左右，虽然随洗脱液量的增加洗脱率也有所增大，但这样既浪费洗脱液用量又洗下更多的杂质而降低了产物的纯度。因9BV以上的洗脱液在HPLC图谱中有更加明显的杂峰出现，故洗脱剂用量为7BV适宜。
（2）最佳上样量的考察
取5份预处理好的D101型大孔树脂各5g分别装柱（Ø2.2cm×8.5cm），按照树脂与药材克重之比为：1:3、1:5、1:7、1:9、1:11、1:15的比例，将麦冬上样液动态上样后，收集残留液，水洗脱7BV，合并残留液和水洗脱液，浓缩定容后，测定二苷的含量，观察二苷的流失量与上样量的关系，实验结果见图1。
结果表明树脂与药材比超过1:9后，上样后的残留液及水洗脱液中总皂苷的含量（以峰面积表示）显著增大，故树脂与生药材比为1:9为最大上样量。
三、用D101大孔吸附树脂对麦冬提取液的纯化富集试验
1．精确称取40.08g麦冬药材，用450mL的95%乙醇溶液超声提取3次，过滤合并所有滤液。浓缩，挥干溶剂成浸膏。浸膏加水溶解制成提取液减压浓缩回收至无醇味，转入5mL容量瓶中用甲醇定容待用。
2．取4份预处理好的上述大孔吸附树脂各5g装柱（Ø2.2cm×8.5cm），用上述定容的备用液上柱，控制一定的流速（3BV／h），待上样完毕，用50mL蒸馏水洗涤每支树脂柱。用7BV量50%乙醇洗脱树脂柱，收集合并所有洗脱液浓
缩至适量真空干燥，得1.263g干膏。测得干膏中皂苷A含量高达0.16%，皂苷B含量高达0.036%。
四、讨论
通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，发现树脂的极性、比表面积等因素直接影响树脂吸附容量和解吸率。用D－101大孔吸附树脂富集、麦冬总皂苷，可以有效除去糖类等水溶性杂质及大部分的脂溶性杂质，虽然总皂甙含量只有0.163％，但采用D101大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的富集使麦冬皂苷A含量提高32倍，使麦冬皂苷B的含量提高36倍。在选择洗脱剂时，考虑到甲醇、丙酮的毒性，以及醋酸乙脂的挥发性等因素，以实际工业生产的可行性和工作中安全、成本等问题，以乙醇一水体系作为解吸剂，解析率高达96.75%。
参考文献：
[1]何平、代赵明，麦冬总皂甙对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用[J]，微循环学杂志， 2005.15（2）.
[2]孔令义等，中药制药化学[M]，北京：中国医药科技出版社，2007.4（34-39）.
[3]任仁安，中药鉴定学[M]，上海：上海科技出版社，1986.11（81-82）.
[4]安如彬、安如彬、马勇、樊新斌、高鹏、赵素云、臧树良，D-101大孔吸附树脂纯化苜蓿总皂甙的工艺研究[J]，辽宁大学学报，2008.35（1）.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”
[关键词]麦冬 大孔吸附树脂 总皂甙
中图分类号：O6-0 文献标识码：A 文章编号：1671－7597（2008）1220002－02
麦冬（Radix Ophiopogonis）为百合科植物沿阶草冬，以块根入药。味甘、微苦，性凉、滋阴生津、润肺止咳、清心除烦。
麦冬中含有麦冬皂甙有抗心律失常作用，对缺血性老损伤有保护作用，对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤有保护作用[1]。麦冬中皂甙越来越受到广泛的关注。大孔吸附树脂为一种选择性的有机高聚吸附剂，具有吸附快、解吸快、吸附容量大、易于再生、使用寿命长等优点[2]。大孔吸附树脂现已被广泛应用于天然产物的分离和富集，但在麦冬中总皂甙富集纯化等方面的研究报道还不多。本文通过对5种不同类型的大孔吸附树脂的优选，旨在讨论D-101大孔吸附树脂对麦冬中总皂甙的纯化富集工艺参数，而对工业大生产提供数据参考支持。
一、仪器与材料
（一）仪器
Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；星海旋转蒸发器（无锡市星海王生生化设备有限公司）。玻璃填充柱（Ø2.2cm×8.5cm）；电子天平（梅特勒－托利多仪器（上海）有限公司）；JAC-150超声波清洗仪（山东济宁奥波超声电器有限公司）。
（二）药材及试剂
HPD100大孔树脂（河北沧州宝恩化工有限公司）；D101大孔树脂（上海摩述公司）；XDA-1B大孔树脂（北京惠德易科技有限公司）；D001大孔换树脂（安徽三星树脂公司）；D311大孔树脂（蚌埠市辽源新材料有限公司）。麦冬皂苷A（AR，四川维科奇生物有限公司）；麦冬皂苷B（AR，上海海灿生物科技有限公司）；乙醇、乙氰，AR级；水（二次蒸馏，临用前自制）。
二、方法与结果
（一）麦冬皂苷A和麦冬皂苷B总皂苷含量的测定
1．HPLC色谱条件色谱柱：Cosmosil-C18（4.6mm×250mm，5um）；流动相：水乙腈（80:20）；检测波长：213nm；柱温：30℃；流速为1.0mL／min；进样量，10uL。
2．对照品溶液的制备精密称取麦冬皂苷A对照品1.02mg，麦冬皂苷B对照品0.202mg，用甲醇溶解定容至2mL，备用。
3．供试液的制备称取适量的麦冬用10倍乙醇超声提取30min3次，过滤，合并滤液后浓缩，挥干溶剂成浸膏。浸膏加水溶解制成提取液，加水定容至浓度为1.00g／mL作上样液，上大孔树脂，收集过大孔树脂的残留液、水洗脱液与不同浓度的乙醇洗脱液。将提取液、上样液、残留液和各洗脱液浓缩、挥去溶剂，用甲醇定容后作供试液。
（二）大孔树脂富集麦冬总皂苷工艺的单因素考察
1．大孔树脂预处理及装柱大孔树脂用95％乙醇浸泡24h，漂去上层漂浮的杂质及细小颗粒，大孔树脂用抽滤瓶抽干乙醇后，加乙醇湿法上柱，并测定柱体积，再用乙醇洗脱至流出液加水不变混浊为止（乙醇：水=1:3），再用水洗脱至无醇味，备用。实验室配制标准试液（麦冬皂苷A：麦冬皂苷B=5:1）备用[3]。
2．静态吸附试验
精确称取HPD100大孔树脂，D-101大孔树脂，XDA-1B大孔树脂，D001 大孔换树脂，D311大孔树脂五种大孔吸附树脂脂各2g，置于100 mL的具磨口的锥形瓶中，加入50 mL的自制标准皂苷试液，吸附完全后的试液呈皂苷阳性反应；于室温下静态吸附24h，充分吸附后过滤，测定剩余溶液中总皂甙的浓度，按下式计算各树脂对总生物碱的吸附容量（mg·g-1干树脂）
Q=（C。－C）V/W
式中Q为吸附量（mg·g），C。为初始浓度（mg·mL），C为剩余质量浓度（mg·mL），V为溶液体积（mL），W为树脂质量（g）。结果见表1。
从表1中可以清楚地看出非极性的D101和HPD100树脂吸附容量较大，而相应的D001、D311及XDA-1B的吸附容量要小一些。
3．动态吸附实验
精密称取D101树脂5g，将预处理好的树脂装入玻璃色谱柱中，将自制标准溶液上柱，控制一定的流速（3BV／h），待流出液呈皂苷阳性反应时，停止上样，上样量为98mL计算吸附量：Q=（C0－C）V/W。结果显示D101树脂对麦冬中的总皂苷动吸附量最大，达22.6mg·g-1，吸附率高达96.1%而HPD100动态吸附容量为18.4mg·g-1，远小于D101的吸附容量。因此选择D101大孔吸附树脂进行进一步的动态解吸附实验。
（1）动态解吸附试验
① 蒸馏水用量的确定
取5根处理过的大孔吸附树脂柱（每根柱装5g树脂），进样量平均约为60mL，先用蒸馏水洗脱，用量分别为30mL，40mL，50mL，60mL，70mL，然后进行糖类鉴定，直到洗脱液Molish反应呈阴性为止[4]．用50mL蒸馏水洗脱时，洗脱液就呈阴性反应。故用50mL蒸馏水洗脱完全可以洗去糖类的杂质成分。
② 乙醇浓度的选择
将已吸附好样品的D101树脂先用50mL水洗脱，再用10％，30％，50％，70％，90％乙醇溶液各200mL进行解吸，流速控制2BV·h-1，接取流份，计算解吸率。结果解吸率分别为4.59％，58.36％，96.75％，97.22％，98.32％。可见解吸率随乙醇浓度的增加而增大，10％，30％乙醇解吸率很低，50％乙醇即可将大部分总皂苷的解吸，但乙醇浓度超过50％以后，解吸率有增加但很小，考虑到工业大生产中的成本因素，所以选择浓度为50%的乙醇作为洗脱剂。
③ 洗脱剂用量的确定
取5份预处理好的上述大孔吸附树脂各5g装柱（Ø2.2cm×8.5cm），加入自制标准试液。先用水洗50mL（约2BV），再用上述50％的乙醇溶液依次洗脱3BV、5BV、7BV、9BV、11BV，合并各洗脱液经浓缩定容后测定总皂苷含量，其测定结果见表2。
试验表明用50%的乙醇7BV的量洗脱，对两种皂苷的洗脱率高达96%左右，虽然随洗脱液量的增加洗脱率也有所增大，但这样既浪费洗脱液用量又洗下更多的杂质而降低了产物的纯度。因9BV以上的洗脱液在HPLC图谱中有更加明显的杂峰出现，故洗脱剂用量为7BV适宜。
（2）最佳上样量的考察
取5份预处理好的D101型大孔树脂各5g分别装柱（Ø2.2cm×8.5cm），按照树脂与药材克重之比为：1:3、1:5、1:7、1:9、1:11、1:15的比例，将麦冬上样液动态上样后，收集残留液，水洗脱7BV，合并残留液和水洗脱液，浓缩定容后，测定二苷的含量，观察二苷的流失量与上样量的关系，实验结果见图1。
结果表明树脂与药材比超过1:9后，上样后的残留液及水洗脱液中总皂苷的含量（以峰面积表示）显著增大，故树脂与生药材比为1:9为最大上样量。
三、用D101大孔吸附树脂对麦冬提取液的纯化富集试验
1．精确称取40.08g麦冬药材，用450mL的95%乙醇溶液超声提取3次，过滤合并所有滤液。浓缩，挥干溶剂成浸膏。浸膏加水溶解制成提取液减压浓缩回收至无醇味，转入5mL容量瓶中用甲醇定容待用。
2．取4份预处理好的上述大孔吸附树脂各5g装柱（Ø2.2cm×8.5cm），用上述定容的备用液上柱，控制一定的流速（3BV／h），待上样完毕，用50mL蒸馏水洗涤每支树脂柱。用7BV量50%乙醇洗脱树脂柱，收集合并所有洗脱液浓
缩至适量真空干燥，得1.263g干膏。测得干膏中皂苷A含量高达0.16%，皂苷B含量高达0.036%。
四、讨论
通过对5种大孔吸附树脂的吸附和解吸特性的比较，发现树脂的极性、比表面积等因素直接影响树脂吸附容量和解吸率。用D－101大孔吸附树脂富集、麦冬总皂苷，可以有效除去糖类等水溶性杂质及大部分的脂溶性杂质，虽然总皂甙含量只有0.163％，但采用D101大孔吸附树脂对麦冬总皂苷的富集使麦冬皂苷A含量提高32倍，使麦冬皂苷B的含量提高36倍。在选择洗脱剂时，考虑到甲醇、丙酮的毒性，以及醋酸乙脂的挥发性等因素，以实际工业生产的可行性和工作中安全、成本等问题，以乙醇一水体系作为解吸剂，解析率高达96.75%。
参考文献：
[1]何平、代赵明，麦冬总皂甙对培养心肌细胞缺氧再给氧损伤的保护作用[J]，微循环学杂志， 2005.15（2）.
[2]孔令义等，中药制药化学[M]，北京：中国医药科技出版社，2007.4（34-39）.
[3]任仁安，中药鉴定学[M]，上海：上海科技出版社，1986.11（81-82）.
[4]安如彬、安如彬、马勇、樊新斌、高鹏、赵素云、臧树良，D-101大孔吸附树脂纯化苜蓿总皂甙的工艺研究[J]，辽宁大学学报，2008.35（1）.
注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”