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【摘要】目的：调查甘肃地区汉族人群中白细胞介素-4-590（IL-4-590）位点单核苷酸多态性的分布状况并明确其与乙肝后肝纤维化(HF)发生的关系。方法：采用聚合酶链式反应-序列特异性引物法结合限制性酶切片段长度多态性技术研究。结果：甘肃地区汉族人群中IL-4-590位点单核苷酸多态性存在TT、CT、CC三种类表现型。
【关键词】肝纤维化；白细胞介素-4；基因多态性；乙型肝炎
1研究对象和材料
1.1研究对象
2010年7月至2011年6月在兰州大学第一医院感染科就诊的甘肃汉族乙肝后HF患者共133例，其中男性95例，女性38例，年龄自19～81岁，平均年龄48.12±13.71岁；其中经病理组织确诊43例，经B超诊断90例。
1.2纳入与排除标准：纳入血清HBsAg阳性6个月以上，HF指标升高并经B超或病理组织检查诊断为HF者。
2试剂和仪器
2.1主要试剂
DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR引物、DNA Marker、5*PBS缓冲液、EB、聚丙烯酰胺等均购自上海生工生物工程有限公司；HF四项放射免疫试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司。
2.2主要仪器
GeneAmpPCR2400扩增仪（美国PE公司）； DYY-Ⅲ-8B电泳仪； WD-9403C型紫外透射反射仪；BioRadGelDoc1000紫外凝胶成像系统； LG15-W高速离心机。
3实验方法
3.1采集外周血3ml提取外周血单个核细胞DNA
3.2采用聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)、限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)分析IL-4-590位点的多态性。
3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳，以未经过酶切的PCR产物判断基因的碱基数，据此，根据酶切后不同的产物判断IL-4基因590位点的多态性。
3结果
3.1IL-4-590位点基因多态性PCR检测结果：
结果显示，IL-4基因-590位点多态性分析PCR产物为203bp。IL-4基因-590位点为T时不能被AvaⅡ酶切，仍为203bp；如IL-4-590位点T变成C则可被AvaⅡ酶识别，酶切产生182bp和21bp两个片段，182bp片段在12%PAGE清晰可见，21bp太小不能见；如果是杂合子则可见203bp和182bp两种条带。
3.2遗传平衡检验
根据正常对照组IL-4-590位点基因多态性在中国甘肃地区汉族人群的分布特点，计算正常汉族人群中IL-4-590位等位基因频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各基因的遗传平衡情况见表1和表2。
表1 乙肝后HF组 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验
χ2=0.882，Ｐ＝0.643>0.05
表2 对照组 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验
χ2=0.186，Ｐ＝0.911>0.05
4讨论
我们检测了甘肃汉族人群中133例乙肝后HF患者和120例健康人群IL-4-590位点的基因多态性。结果表明HF组、对照组的群体都到了遗传平衡，甘肃汉族人群中乙肝后HF患者和健康人群中均存在IL-4-590位点的基因多态性，其中以CT型出现频率最高；乙肝后HF组IL-4-590位点TT型、CT型、CC型频率分别为24.1%、44.4%、31.6%；与 IL-4-590位点SNP频率分析发现，HF组T、C等位基因频率分别为46.2%和53.8%， T等位基因频率HF组明显低于对照组，而C等位基因频率明显高于对照组，两组差异有统计学意义，说明IL-4-590位点单核苷酸多态性分布与乙肝后肝纤维化相关，可能为HBV感染后肝纤维化发生的重要影响因素。
参考文献
[1]Yodota T,Otsuka T,Mosmann T et al. Isolation and characterization of a human interleukin cDNA clone homologous to mouse B-cell stimulatory stimulatory factor 1 that expresses B-cell- and T-cell-stimulatory activities.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:5894.
[2]Boni C,Penna A,Ogg CS.Lamvudine therapy can overcome cytotoxic T-cell hyporesponsiveness in nchronic hepatitis B: new perspectives for immune therapy．Hepatology，2001，33:963.
[3]中华肝脏病肝纤维化学组．肝纤维化诊断及疗效评估共识．中华肝脏病杂志，2002,10(5):327-328.
【关键词】肝纤维化；白细胞介素-4；基因多态性；乙型肝炎
1研究对象和材料
1.1研究对象
2010年7月至2011年6月在兰州大学第一医院感染科就诊的甘肃汉族乙肝后HF患者共133例，其中男性95例，女性38例，年龄自19～81岁，平均年龄48.12±13.71岁；其中经病理组织确诊43例，经B超诊断90例。
1.2纳入与排除标准：纳入血清HBsAg阳性6个月以上，HF指标升高并经B超或病理组织检查诊断为HF者。
2试剂和仪器
2.1主要试剂
DNA提取试剂盒、PCR扩增试剂盒、PCR引物、DNA Marker、5*PBS缓冲液、EB、聚丙烯酰胺等均购自上海生工生物工程有限公司；HF四项放射免疫试剂盒购自上海海研医学生物技术有限公司。
2.2主要仪器
GeneAmpPCR2400扩增仪（美国PE公司）； DYY-Ⅲ-8B电泳仪； WD-9403C型紫外透射反射仪；BioRadGelDoc1000紫外凝胶成像系统； LG15-W高速离心机。
3实验方法
3.1采集外周血3ml提取外周血单个核细胞DNA
3.2采用聚合酶链式反应-序列特异性引物法(PCR-SSP)、限制性酶切片段长度多态性技术(RFLP)分析IL-4-590位点的多态性。
3.3聚丙烯酰胺凝胶电泳，以未经过酶切的PCR产物判断基因的碱基数，据此，根据酶切后不同的产物判断IL-4基因590位点的多态性。
3结果
3.1IL-4-590位点基因多态性PCR检测结果：
结果显示，IL-4基因-590位点多态性分析PCR产物为203bp。IL-4基因-590位点为T时不能被AvaⅡ酶切，仍为203bp；如IL-4-590位点T变成C则可被AvaⅡ酶识别，酶切产生182bp和21bp两个片段，182bp片段在12%PAGE清晰可见，21bp太小不能见；如果是杂合子则可见203bp和182bp两种条带。
3.2遗传平衡检验
根据正常对照组IL-4-590位点基因多态性在中国甘肃地区汉族人群的分布特点，计算正常汉族人群中IL-4-590位等位基因频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，各基因的遗传平衡情况见表1和表2。
表1 乙肝后HF组 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验
χ2=0.882，Ｐ＝0.643>0.05
表2 对照组 Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验
χ2=0.186，Ｐ＝0.911>0.05
4讨论
我们检测了甘肃汉族人群中133例乙肝后HF患者和120例健康人群IL-4-590位点的基因多态性。结果表明HF组、对照组的群体都到了遗传平衡，甘肃汉族人群中乙肝后HF患者和健康人群中均存在IL-4-590位点的基因多态性，其中以CT型出现频率最高；乙肝后HF组IL-4-590位点TT型、CT型、CC型频率分别为24.1%、44.4%、31.6%；与 IL-4-590位点SNP频率分析发现，HF组T、C等位基因频率分别为46.2%和53.8%， T等位基因频率HF组明显低于对照组，而C等位基因频率明显高于对照组，两组差异有统计学意义，说明IL-4-590位点单核苷酸多态性分布与乙肝后肝纤维化相关，可能为HBV感染后肝纤维化发生的重要影响因素。
参考文献
[1]Yodota T,Otsuka T,Mosmann T et al. Isolation and characterization of a human interleukin cDNA clone homologous to mouse B-cell stimulatory stimulatory factor 1 that expresses B-cell- and T-cell-stimulatory activities.Proc Natl Acad Sci USA,1986;83:5894.
[2]Boni C,Penna A,Ogg CS.Lamvudine therapy can overcome cytotoxic T-cell hyporesponsiveness in nchronic hepatitis B: new perspectives for immune therapy．Hepatology，2001，33:963.
[3]中华肝脏病肝纤维化学组．肝纤维化诊断及疗效评估共识．中华肝脏病杂志，2002,10(5):327-328.