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[摘要]：目的通过一起腹泻事件的调查处理和实验室检验，迅速，准确检出病原体，为疫情处理提供科学依据。方法病人肛拭，剩余食品按照GB4789增菌，分离，通过形态，生化，血清学实验，噬菌体，PCR结合进行鉴定;药敏实验采用K一B法，生活饮用水采用GB/T5750.12-2006检验。结果病人肛拭23件，其中3，9，12，16号检出EIEC;生活饮用水6件总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌均>1600MPN/100ml，未检出EIEC及其它致病菌;剩余食品9件未检出EIEC及其它致病菌。结论经流行病学调查，临床症状，实验室检验结果，确认为是一起由肠道侵袭性大肠埃希氏菌（以下简称EIEC）引起的感染性腹泻事件。
[中图分类号]R941.3 [文献标识码]A [文章编号]2107-2306（2020）04-297-02
2019-4-30，酉阳县疾控中心接到辖区一医院报告，该院陆续收到一批发热，恶心，呕吐，腹痛，腹泻的病人，我中心立即前往现场，开展流行病学调查，采样，实验室检验。后经流行病学调查，临床症状，实验室检验结果，确认为是一起由肠道侵袭性大肠埃希氏菌引起的感染性腹泻事件，本文仅从病原菌检验部分分析与同行交流。
1样品名称
病人肛拭23件，生活饮用水6件，剩余食品9件。
2检验依据
GB4789[1-8]，《霍乱防治手册》第六版[9]，GB/T5750.12-2006[10]
3检验项目
沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，霍乱弧菌，致泻性大肠埃希氏菌，副溶血性弧菌，单核细胞增生李斯特氏菌，蜡样芽胞杆菌。
4检验仪器及试剂
沙门氏菌，李斯特氏菌，0157显色平板，弧菌显色平板，金黄色葡萄球菌显色平板来自郑州博赛公司，生产批号20181112;其它成品培养基均来自青岛海博技术有限公司，在有效期内使用;沙门氏菌属诊断血清，志贺氏菌属诊断血清，霍乱弧菌抗体A，B，C，霍乱弧菌0139群诊断血清生产批号20190101EPEC，EIEC，ETEC，0157诊断血清，生产批号20181201均来自宁波天润公司;五种致泻大肠埃希氏菌PCR试剂来自北京卓诚公司，生产批号20190301。肠杆菌科噬菌体（7滴法），大肠埃希氏菌分型噬菌体来自金羿噬菌体公司，生产批号20190108;VITEK2来自生物梅里埃公司，PCR仪型号AFD9600，生产厂家达安公司。
5检验步骤
5.1取各样品半固体直接划线分离于SS，DHL，沙门氏菌显色平板，Mac，EMB，SMAC，0157显色平板，PALCAM，李斯特显色平板，MYP，4号琼脂，TCBS，弧菌显色平板，血平板，经适宜条件培养后观察结果。生活饮用水检测总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌且做上述致病菌检测。
5.2分别取各样品半固体Iml，加入到10mlBPW，TTB，SC，志贺菌增菌肉汤，7.5%氯化钠肉汤，APW，LB1，EC，改良EC肉汤，胰酪胨大豆多粘菌素肉汤。经适宜条件培养后，分别转种于上述分离平板，经适宜条件培养后，观察结果。
5.3PCR取各样品半固体Iml于10ml营养肉汤中，经37C6h后，取400微升按试剂说明书，进行操作。
5.4经观察，在3，9，12，16号样品在SS，DHL，Mac，EMB上有无色，半透明，中等大小的菌落生长;其余平板均未见可疑菌落生长。
5.5分别取上述可疑菌落进行纯培养，用VITEK2进行生化鉴定、手工生化、血清学实验、肠杆菌科噬菌体实验、Sh噬菌体原液/IRTD及PCR实验、大肠埃希氏菌分型噬菌体实验，药敏实验;结果见表1-5。
5.63，9，12.16号菌株与EPEC.EIECETEC，O157诊断血清均未凝集。
5.73，9，12，16号菌株经上机鉴定为大肠埃希氏菌，且赖AA-，动力-，PCR鉴定为EIEC且检出ipaH，CT值均小于30。
6检验结果
病人肛拭23件，其中3，9，12，16号检出EIEC;生活饮用水6件总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌>1600MPN/100ml，未检出EIEC及其它致病菌;剩余食品9件未检出EIEC及其它致病菌。
讨论
1致泻性大肠埃希氏菌共分为5种即EPEC致病性大肠埃希氏菌，EIEC侵袭性，ETEC产肠毒素大肠埃希氏菌，EHEC出血性大肠埃希氏菌，EaggEC肠集聚性大肠埃希氏菌，统称DEC。EPEC主要引起幼儿发病，发热，粘液便，靠eae，bfp致病;EIEC引起类似痢疾症状，腹部剧痛，有粘液便，脓血便，靠ipaH致病;ETEC引起腹痛，腹泻，引起旅游者，类似霍乱症状，靠肠毒素LT，ST致病;EHEC是引起出血性肠炎，痉挛性疼痛，鲜血样粪便，依赖stxl，stx2致病;EaggEC引起腹痛腹泻，靠eagg，astA致病。现在国内每年发生的食物中毒中，无论中毒次数还是发病人数均以微生物为主，微生物中又以细菌性食物中毒为主。细菌性食物中毒或感染性腹泻中，致泻性大肠埃希氏菌占有重要地位。对于DEC的检测，国家标准现为生化反应+PCR，对于生化反应符合株检测相应毒力基因来确诊。笔者查阅多篇报道，发现几乎所有食物中毒株均能进行血清学定型。本次事件由EIEC引起。侵袭性致泻大肠埃希氏菌（EIEC）可通过污染的水和食物引起暴发或流行，也可因接触传播形成散发病例;成人、儿童均可发，临床表现与菌痢相似，主要为腹痛、腹泻、发热、脓血便等"2;EIEC未定型，是否与诊断血清种类较少，涵盖不够有关，值得进一步商讨;根据OAg，HAg.KAg来判定菌型更准确，尤其是OAg结合HAg会更准确。
2由于在EMB，Mac上，EIEC与志賀氏菌难以区分，均为无色，半透明，中等大小的菌落，区分二者可采用各种实验如酒石酸盐，醋酸盐，粘液酸，葡萄糖铵等，但区分大肠埃希氏菌与志贺氏菌以葡萄糖铵最好，大肠埃希氏菌葡萄糖铵+，志贺氏菌葡萄糖铵一。实验发现，4株菌株葡萄糖铵+见表1，经上机鉴定也为大肠埃希氏菌。我们在实验中采用何晓青的肠杆菌科噬菌体效果很好，可以省去常规生化鉴定。我们发现4株菌裂解模式一致见表2，均出现Sh原液裂解，IRTD不裂解见表3。Sh类似于ipaH，它作用于细菌细胞壁受体，可使志贺氏菌及EIEC裂解。可以采用三步法进行筛选，葡萄糖铵+;赖AA-，动力-（除0124动力+外）;选取Sh原液裂解，1RTD不裂解的菌株结合检出ipaH即可鉴定为EIEC。国家标准规定赖AA-，动力-（除0124动力+外），可以防止将普通大肠埃希氏菌误诊为EIEC。我们采用生化反应，噬菌体结果与PCR结果结合，可使结果更准确。 3对于药敏实验，我们采用K一B法，见表5发现4株菌对氟哌酸，先锋霉素，庆大霉素，红霉素，诺氟沙星，新霉素，环丙沙星，头胞拉定，头胞唑林，阿莫西林/克拉维酸敏感;对四环素，复方新诺明，链霉素，青霉素，恩诺沙星，林可霉素，磺胺嘧啶钠，阿米卡星，氨苄西林耐药。及时检测菌株耐药情况，合理使用抗生素，对于减少耐药菌株的出现非常有必要"。近年来，由于临床和养殖业对抗生素的不合理使用，导致耐药菌株尤其多耐菌株的出现。我们按照每次接种量接近的情况下，4株菌出现大小一致的抑菌环见表5，也间接说明4株菌同出一源。我们采用大肠埃希氏菌分型噬菌体发现4株菌，原液/1RTD型别均为10/12型，说明本次事件菌株同出一源。现在，国内外以PFGE作为检测菌株同源性的金标准，脉冲场凝胶电泳方法被广泛应用于追踪细菌性传染病的暴发流行、识别散发病例的传染源，从而有效预防疫情的发生叫大肠埃希氏菌分型噬菌体可以达到与之接近的水平，价格便宜，易操作，适合基层实验室开展。
4本次事件由于医院报告不及时，病人多数均是看病输液或自行购买抗生素治疗，可使检出率降低;从6件生活饮用水检出总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌，并均>1600MPN/100ml，虽未检出EIEC及其它致病菌，但也说明水质消毒不过关，有介水传染病发生的风险。据丁业荣报道五年来，定点、定时检测不同的水源水（河、塘水）1080份，分离到致泻大肠埃希菌149株，阳性检出率为13.80%[15]，腹泻病人感染致泻大肠埃希菌与水源水污染有密切关系[14]，可见水质问题，应高度重视，应由水质监管部门加强监管，定期监测水样，工作人员严格落实消毒措施，切实保障人民群众饮水安全。加强农村动物粪便的管理，规范屠宰程序是切断致泻性大肠埃希氏菌对环境与食品污染的重要措施[16]。当前，农村的自备水源存在着一定的隐患，相关部门应做好自备供水的审批和监管工作[17]。
参考文献
[1]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，GB4789.31-2013食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌、志贺氏菌和致泻大肠埃希氏菌的肠杆菌科噬菌体诊断检验[S].北京：中国标准出版社，2014
[2]中华，人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.4-2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2018
[3]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.5-2012食品安全国家标准食品微生物学检验志贺氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2018
[4]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.6-2016食品安全国家标准食品微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验[S]北京：中国标准出版社，2018
[5]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.30-2016食品安全国家标准食品微生物学检验单核细胞增生李斯特氏菌检验[S].北京：中国标准出版社，2018
[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验[S]北京：中国标准出版社，2018
[7]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.10-2016食品安全国家标准食品微生物学检验金黄色葡萄球菌检验[S].北京：中国标准出版社，2018
[8]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.7-2013食品安全国家标准食品微生物学检
验副溶血性弧菌檢验[S].北京：中国标准出版社，2018
[9]中华人民共和国卫生部，卫生部《霍乱防治手册》第六版（2013年）[S].北京：2013
[10]中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会GB/T5750.12-2006生活饮用水标准检验方法微生物指标[S].北京：中国标准出版社
[11]姚齐龙，陈玲一起肠侵袭性大肠杆菌引起食物中毒的调查[J].现代预防医学，2005，32（9）：1164-1164.
[12]杨梦，熊长辉，王鹏，等一起侵袭性大肠埃希菌食物中毒事件的溯源分析[J].现代预防医学，2015，42（5）：810-813.
[13]董洪燕，杨建国，马智龙，等.泰州市腹泻病人中致泻大肠埃希氏菌感染状况及病原学特征分析[J].现代预防医学2016，43（2）：333-337
[14]刘凯，袁雪姣，赵爱兰，等.肠致病性大肠杆菌分离株的脉冲场凝胶电泳分析[J].现代预防医学，2015，42（4）：674-677.
[15]丁业荣时全，李朝阳，等.致泻大肠埃希菌在水源水中的分布与腹泻病关系的研究[J].中国人兽共患病杂志2005，21（11）：968-971
[16]韩秀兰，柳连顺，杜敏，等石家庄市环境样品中致泻性大肠埃希氏菌的分离与鉴定[J].预防医学文献信息2002，8（2）：137-138
[17]郭长山，宋健，郭卫东，等一起因饮用水污染导致的学校胃肠炎暴发调查[J].现代预防医学2017，44（7）：1324-1326
[中图分类号]R941.3 [文献标识码]A [文章编号]2107-2306（2020）04-297-02
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1样品名称
病人肛拭23件，生活饮用水6件，剩余食品9件。
2检验依据
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3检验项目
沙门氏菌，志贺氏菌，金黄色葡萄球菌，霍乱弧菌，致泻性大肠埃希氏菌，副溶血性弧菌，单核细胞增生李斯特氏菌，蜡样芽胞杆菌。
4检验仪器及试剂
沙门氏菌，李斯特氏菌，0157显色平板，弧菌显色平板，金黄色葡萄球菌显色平板来自郑州博赛公司，生产批号20181112;其它成品培养基均来自青岛海博技术有限公司，在有效期内使用;沙门氏菌属诊断血清，志贺氏菌属诊断血清，霍乱弧菌抗体A，B，C，霍乱弧菌0139群诊断血清生产批号20190101EPEC，EIEC，ETEC，0157诊断血清，生产批号20181201均来自宁波天润公司;五种致泻大肠埃希氏菌PCR试剂来自北京卓诚公司，生产批号20190301。肠杆菌科噬菌体（7滴法），大肠埃希氏菌分型噬菌体来自金羿噬菌体公司，生产批号20190108;VITEK2来自生物梅里埃公司，PCR仪型号AFD9600，生产厂家达安公司。
5检验步骤
5.1取各样品半固体直接划线分离于SS，DHL，沙门氏菌显色平板，Mac，EMB，SMAC，0157显色平板，PALCAM，李斯特显色平板，MYP，4号琼脂，TCBS，弧菌显色平板，血平板，经适宜条件培养后观察结果。生活饮用水检测总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌且做上述致病菌检测。
5.2分别取各样品半固体Iml，加入到10mlBPW，TTB，SC，志贺菌增菌肉汤，7.5%氯化钠肉汤，APW，LB1，EC，改良EC肉汤，胰酪胨大豆多粘菌素肉汤。经适宜条件培养后，分别转种于上述分离平板，经适宜条件培养后，观察结果。
5.3PCR取各样品半固体Iml于10ml营养肉汤中，经37C6h后，取400微升按试剂说明书，进行操作。
5.4经观察，在3，9，12，16号样品在SS，DHL，Mac，EMB上有无色，半透明，中等大小的菌落生长;其余平板均未见可疑菌落生长。
5.5分别取上述可疑菌落进行纯培养，用VITEK2进行生化鉴定、手工生化、血清学实验、肠杆菌科噬菌体实验、Sh噬菌体原液/IRTD及PCR实验、大肠埃希氏菌分型噬菌体实验，药敏实验;结果见表1-5。
5.63，9，12.16号菌株与EPEC.EIECETEC，O157诊断血清均未凝集。
5.73，9，12，16号菌株经上机鉴定为大肠埃希氏菌，且赖AA-，动力-，PCR鉴定为EIEC且检出ipaH，CT值均小于30。
6检验结果
病人肛拭23件，其中3，9，12，16号检出EIEC;生活饮用水6件总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌>1600MPN/100ml，未检出EIEC及其它致病菌;剩余食品9件未检出EIEC及其它致病菌。
讨论
1致泻性大肠埃希氏菌共分为5种即EPEC致病性大肠埃希氏菌，EIEC侵袭性，ETEC产肠毒素大肠埃希氏菌，EHEC出血性大肠埃希氏菌，EaggEC肠集聚性大肠埃希氏菌，统称DEC。EPEC主要引起幼儿发病，发热，粘液便，靠eae，bfp致病;EIEC引起类似痢疾症状，腹部剧痛，有粘液便，脓血便，靠ipaH致病;ETEC引起腹痛，腹泻，引起旅游者，类似霍乱症状，靠肠毒素LT，ST致病;EHEC是引起出血性肠炎，痉挛性疼痛，鲜血样粪便，依赖stxl，stx2致病;EaggEC引起腹痛腹泻，靠eagg，astA致病。现在国内每年发生的食物中毒中，无论中毒次数还是发病人数均以微生物为主，微生物中又以细菌性食物中毒为主。细菌性食物中毒或感染性腹泻中，致泻性大肠埃希氏菌占有重要地位。对于DEC的检测，国家标准现为生化反应+PCR，对于生化反应符合株检测相应毒力基因来确诊。笔者查阅多篇报道，发现几乎所有食物中毒株均能进行血清学定型。本次事件由EIEC引起。侵袭性致泻大肠埃希氏菌（EIEC）可通过污染的水和食物引起暴发或流行，也可因接触传播形成散发病例;成人、儿童均可发，临床表现与菌痢相似，主要为腹痛、腹泻、发热、脓血便等"2;EIEC未定型，是否与诊断血清种类较少，涵盖不够有关，值得进一步商讨;根据OAg，HAg.KAg来判定菌型更准确，尤其是OAg结合HAg会更准确。
2由于在EMB，Mac上，EIEC与志賀氏菌难以区分，均为无色，半透明，中等大小的菌落，区分二者可采用各种实验如酒石酸盐，醋酸盐，粘液酸，葡萄糖铵等，但区分大肠埃希氏菌与志贺氏菌以葡萄糖铵最好，大肠埃希氏菌葡萄糖铵+，志贺氏菌葡萄糖铵一。实验发现，4株菌株葡萄糖铵+见表1，经上机鉴定也为大肠埃希氏菌。我们在实验中采用何晓青的肠杆菌科噬菌体效果很好，可以省去常规生化鉴定。我们发现4株菌裂解模式一致见表2，均出现Sh原液裂解，IRTD不裂解见表3。Sh类似于ipaH，它作用于细菌细胞壁受体，可使志贺氏菌及EIEC裂解。可以采用三步法进行筛选，葡萄糖铵+;赖AA-，动力-（除0124动力+外）;选取Sh原液裂解，1RTD不裂解的菌株结合检出ipaH即可鉴定为EIEC。国家标准规定赖AA-，动力-（除0124动力+外），可以防止将普通大肠埃希氏菌误诊为EIEC。我们采用生化反应，噬菌体结果与PCR结果结合，可使结果更准确。 3对于药敏实验，我们采用K一B法，见表5发现4株菌对氟哌酸，先锋霉素，庆大霉素，红霉素，诺氟沙星，新霉素，环丙沙星，头胞拉定，头胞唑林，阿莫西林/克拉维酸敏感;对四环素，复方新诺明，链霉素，青霉素，恩诺沙星，林可霉素，磺胺嘧啶钠，阿米卡星，氨苄西林耐药。及时检测菌株耐药情况，合理使用抗生素，对于减少耐药菌株的出现非常有必要"。近年来，由于临床和养殖业对抗生素的不合理使用，导致耐药菌株尤其多耐菌株的出现。我们按照每次接种量接近的情况下，4株菌出现大小一致的抑菌环见表5，也间接说明4株菌同出一源。我们采用大肠埃希氏菌分型噬菌体发现4株菌，原液/1RTD型别均为10/12型，说明本次事件菌株同出一源。现在，国内外以PFGE作为检测菌株同源性的金标准，脉冲场凝胶电泳方法被广泛应用于追踪细菌性传染病的暴发流行、识别散发病例的传染源，从而有效预防疫情的发生叫大肠埃希氏菌分型噬菌体可以达到与之接近的水平，价格便宜，易操作，适合基层实验室开展。
4本次事件由于医院报告不及时，病人多数均是看病输液或自行购买抗生素治疗，可使检出率降低;从6件生活饮用水检出总大肠菌群，耐热大肠菌群，大肠埃希氏菌，并均>1600MPN/100ml，虽未检出EIEC及其它致病菌，但也说明水质消毒不过关，有介水传染病发生的风险。据丁业荣报道五年来，定点、定时检测不同的水源水（河、塘水）1080份，分离到致泻大肠埃希菌149株，阳性检出率为13.80%[15]，腹泻病人感染致泻大肠埃希菌与水源水污染有密切关系[14]，可见水质问题，应高度重视，应由水质监管部门加强监管，定期监测水样，工作人员严格落实消毒措施，切实保障人民群众饮水安全。加强农村动物粪便的管理，规范屠宰程序是切断致泻性大肠埃希氏菌对环境与食品污染的重要措施[16]。当前，农村的自备水源存在着一定的隐患，相关部门应做好自备供水的审批和监管工作[17]。
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[6]中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会，国家食品药品监督管理总局GB4789.14-2014食品安全国家标准食品微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验[S]北京：中国标准出版社，2018
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[14]刘凯，袁雪姣，赵爱兰，等.肠致病性大肠杆菌分离株的脉冲场凝胶电泳分析[J].现代预防医学，2015，42（4）：674-677.
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