【摘 要】
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目的利用直接贴壁法体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,并检测其分化效率。方法人胚胎干细胞以1×105个/cm2的细胞密度传代到铺备有基质胶的培养皿中培养,用带8 ng/ml碱性
【机 构】
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首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科,中科院动物研究所生物膜与膜生物工程国家重点实验室,
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目的利用直接贴壁法体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,并检测其分化效率。方法人胚胎干细胞以1×105个/cm2的细胞密度传代到铺备有基质胶的培养皿中培养,用带8 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的条件培养基培养6 d后,更换为RPMI 1640-B27培养基,同时加入100 ng/ml的人重组activin A处理24 h,接着再加入10 ng/ml的人重组骨形态发生蛋白4(BMP4)处理4 d,之后更换为不带诱导因子的RPMI 1640-B27培养基,每隔2～3 d换1次培养基,持续2～3周。在光学显微镜下观察记录出现跳动心肌细胞的时间和跳动频率,并计算跳动克隆百分比,24孔板一组,共记录4组96孔;用免疫荧光染色法检测心肌细胞特异标志物心肌肌钙蛋白T(cTnT);膜片钳实验检测心肌细胞自发性动作电位;跳动心肌细胞经过24 h缺氧刺激后,用凋亡试剂盒检测心肌细胞凋亡比例。结果大量的自发跳动心肌细胞在诱导分化13 d左右开始出现。分化出现自发跳动心肌细胞的时间为(13.0±1.1)d,百分比为66.7%,跳动频率为(63.0±7.0)次/分;跳动心肌细胞cTnT染色阳性;跳动心肌细胞检测到自发性动作电位;跳动心肌细胞缺氧24 h后检测到凋亡比率为8.0%±0.5%。结论国内首次利用直接贴壁法在体外诱导人胚胎干细胞分化为心肌细胞,分化效率达到66.7%,分化时间13 d左右。
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