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摘 要：利用响应曲面法，对影响清真牛肉香肠感官品质、脂肪氧化和保质期的超高压参数进行了试验优化设计，建立了各响应值的二次多项式数学模型，验证了模型的有效性。结果表明：在处理压力200～600MPa、保压时间5～25min、处理温度20～60℃的模型区间内，此3者均为影响感官品质和保质期的显著影响因子，显著顺序为处理压力>保压时间>处理温度，并得出超高压处理清真牛肉香肠感官品质和保质期的最优工艺参数：压力473.59MPa，时间14.94min、温度20℃。在此条件下清真牛肉香肠的硬度2785g、弹性0.6711、内聚力0.2871、咀嚼度673.8、硫代巴比妥酸还原值0.6888mg/100g，感官评价16.16，保质期26.34d。
关键词：清真牛肉香肠；超高压；响应曲面法；质构分析；感官评价；脂肪氧化；保质期
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0010-09
超高压作为一项新型非热加工技术，在肉制品低温杀菌和延长货架期[1-3]、钝化酶类[4-6]及改善感官品质[7-9]等方面显示出不可替代的优越性。由于该技术的作用机理是单纯的物理作用，能够最大程度地保持肉制品原有的色香味型[5]，对产品不会造成显著的影响[10]。目前，日本及欧美发达国家已实现了超高压加工产业化，并将其应用于肉制品加工中，如切片火腿、帕尔马火腿、西班牙风干火腿、色拉米香肠[11]、熟制鸡肉等[12]。
清真食品是中华传统饮食文化的一个重要组成部分，其中清真牛肉香肠是其中消费量最大的一种。目前该类香肠主要按照西式低温熏煮香肠的加工方式生产[13]，但是由于在加工过程中热处理水平较低，在包装过程中容易被二次污染[14]，在真空包装且有冷链保藏的条件下，2周左右也会出现腐败的现象[15]。
本实验为探索超高压在熏煮香肠加工方面的应用，采用不同压力、时间和温度的组合处理清真牛肉香肠，通过响应曲面法进行试验设计，研究超高压处理对清真牛肉香肠的感官品质、脂肪氧化及保质期的影响，并优化超高压加工技术参数，为实际生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
清真牛肉香肠配方（kg）：牛肉80、鸡皮20、味精0.3、食盐2.2、亚硝酸钠0.008、异抗坏血酸钠0.1、磷酸盐0.4、白糖2、香辛料0.4、红曲0.3、淀粉5、大豆分离蛋白4、冰水40。
牛肉小黄瓜条购于北京御香苑集团公司；其他辅料均市购。
三氯乙酸、三氯甲烷、氯化钠均为分析纯 北京化学试剂公司；乙二胺四乙酸二钠（生物技术级） 美国Amresco公司；2-硫代巴比妥酸（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基（生物试剂） 北京双旋微生物培养基制品厂；月桂基硫酸盐胰蛋白胨、煌绿乳糖胆盐、结晶紫中性红胆盐琼脂均为生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
ABM-2组织粉碎机 日本日精株式会社；SCR20BC高速冷冻离心机 日本日立公司；UV/VIS-2800分光光度计 尤尼柯（上海）有限公司；TA.XT plus质构仪 英国Stable Micro System公司；HZQ-X100振荡培养箱 哈尔滨东明医疗仪器厂；HPP600/15L高压处理设备 包头科发新型高技术食品机械有限责任公司；LA2-3A1生物安全柜 新加坡ESCO公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
原料修整→滚揉→绞碎→配料→斩拌乳化→灌肠→烟熏蒸煮→冷却→真空包装。
每根香肠（40±5）g，采用胶原蛋白肠衣，每包5根，真空包装袋为聚酰胺/聚乙烯，20℃下包装袋的透氧率为24cm3/（m2·d）。样品制备后在4℃条件下贮藏备用。
1.3.2 样品高压处理
根据设计，将样品在20～60℃条件下分别以200～600MPa处理5～25min，处理时间不包括升、卸压时间。传压介质为水，水温由温控系统控制，升压速度为4MPa/min，降压为瞬时卸压，保压期间波动压力不大于5%，处理结束后，样品于4℃条件下冷却备用。每组样品设3个平行肉样，并设控制组样品。
1.3.3 质构分析
测定使用物性测试仪进行，测定方法采用质构剖面分析法（texture profile analysis，TPA）。参数设置：测试前速度2.0mm/s、测试速度1.0mm/s、测试后速度1.0mm/s、样品压缩比75%、两次压缩中停顿时间为5s，探头类型P50，样品规格1.5cm高的圆柱体，测定时环境温度25℃。测定结果取硬度、弹性、内聚力、咀嚼度4个指标。
1.3.4 脂肪氧化的测定
采用硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法检测[16]。称取10g样品，用组织破碎机充分绞碎后，置于100mL三角烧瓶中，加入50mL质量浓度为7.5g/100mL三氯乙酸溶液（含有质量浓度为0.1g/100mL乙二胺四乙酸二钠），在4℃条件下振摇30min。所得样液经双层滤纸过滤2次，取5mL滤液与5mL 0.02mol/L的2-硫代巴比妥酸溶液混合于50mL离心管中，混合液在90℃水浴条件下保持40min，取出后以流水冷却至室温。混合液5000×g离心5min，取5mL上清液与5mL三氯甲烷混合振荡，待样品分层后，取上层有机相进行在532nm和600nm处进行比色，记录吸光度。每个样品设3个平行样测定，TBARS值按照以下公式计算：
式中：TBARS为硫代巴比妥酸还原值/（mg/100g）；A532及A600分别为丙二醛与2-硫代巴比妥酸的反应产物在532nm和600nm处的最大和最小吸光度；155为丙二醛在532nm处的毫摩尔消光系数。 1.3.5 感官评定
本实验感官评定按照SB/T10279—2008《熏煮香肠》[17]进行，采用双盲法进行检验，即对样品进行密码随机编号（本研究采用3位随机数字）。评定分数采用1～7分制，1分最低，7分最高。每次评定由每个评定人员单独进行不同样品评定之间用温水漱口。感官指标包括：外观、色泽、组织状态、风味。
1.3.6 保质期测定
保质期为样品在4℃低温条件下，其微生物指标符合国标GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》[18]相关规定的保藏时间。具体操作方法参考国标GB4789.2—2010《菌落总数测定》[19]和GB4789.3—2010《大肠菌群计数》[20]进行。
1.4 响应曲面法试验设计
采用Box-Behnken 三因素三水平的响应曲面设计方法，以处理压力、保压时间和处理温度3个因子为自变量，分别表示为x1、x2、x3，确定各试验因子取值范围为200～600MPa、5～25min和20～60℃，分别以X1、X2、X3来表示，并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，试验中自变量因素编码及水平见表1。
以超高压处理清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、脂肪氧化、感官评价及保质期为响应值（Yn），分别进行二次多项回归方程拟合及优化分析，预测模型响应值由最小二乘法拟合的二次多项方程表示：
Yn=B0+B1x1+B2x2+B3x3+B12x1x2+B13x1x3+B23x2x3+B11x12+B22x22+B33x32
式中：Yn为各检测项目的响应值，B0为常数项；B1、B2、B3分别为线性系数；B13、B13、B23分别为交互项系数；B11、B22、B33为二次项系数，需进行至少17组试验来求得各响应值方程的各项系数。
1.5 数据处理及分析
采用统计软件Design Expert V8.0.6（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA.）进行试验设计与数据分析。
2 结果与分析
2.1 响应曲面法优化试验的设计方案与试验结果
采用统计软件Design Expert进行设计并优化出的17组试验安排以及试验结果见表2。
2.2 回归模型建立、方差分析及系数显著性分析
采用统计软件Design Expert对表2试验数据进行二元回归拟合，分别获得硬度（Y1）、弹性（Y2）、内聚力（Y3）、咀嚼度（Y4）、脂肪氧化（Y5）、感官评价（Y6）及保质期（Y7）对编码自变量处理压力、保压时间和处理温度的二次多项式模型方程：
从回归模型方程系数显著性检验表4中可知，一次项x1（压力）、x2（时间）、x3（温度）对于清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、脂肪氧化、感官评价及保质期的影响均极显著（P<0.0001）；二次项x12对清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、感官评价的影响极显著（P<0.01），对脂肪氧化的影响显著（P<0.05），x22对各指标的影响均极显著（P<0.01），x32对于清真牛肉香肠的弹性、咀嚼度、脂肪氧化的影响均极显著（P<0.01），对内聚力的影响显著（P<0.05）；交互项x1x2对清真牛肉香肠的弹性、内聚力、脂肪氧化及保质期的影响均极显著（P<0.01），对硬度、咀嚼度和感官评价的影响显著（P<0.05），x1x3对清真牛肉香肠的硬度、弹性、脂肪氧化的影响极显著（P<0.01），对内聚力、咀嚼度、感官评价、保质期的影响显著（P<0.05），x2x3对清真牛肉香肠的咀嚼度和保质期的影响显著（P<0.05）。
2.3 超高压处理清真牛肉香肠质构的响应面分析
2.3.1 超高压处理清真牛肉香肠硬度的响应面分析
2.3.2 超高压处理清真牛肉香肠弹性的响应面分析
通过对以上响应曲面的分析可知，超高压处理能够有效地延长清真牛肉香肠的微生物保质期，改善香肠的质构指标，但会促进产品的脂肪氧化，对感官品质的影响也逐渐增强。其中处理压力是影响清真牛肉香肠质构、脂肪氧化和保质期的最主要因素，其后为保压时间和温度。对于质构分析中硬度和内聚力的影响，都呈现逐渐下降的趋势，而弹性和咀嚼度则呈现先降后升的情况。随着压力、时间和温度的升高，保质期明显延长，由此也导致脂肪氧化的加剧和感官品质的恶化。通过Design Expert统计软件分别对质构、感官评价、脂肪氧化及保质期进行分析，在600MPa、18min和34.19℃条件下，质构分析中的4个指标达到最好的状态；在597.15MPa、24.94min和33.44℃条件下，保质期可达到47.21d；在200MPa、5min和40℃条件下，TBARS值为0.4371mg/100g；在201.40MPa、5.85min和22.82℃条件下，感官评价达到19.45。对清真牛肉香肠的试验结果进行硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、TBARS值、感官评价和保质期等7项指标联合最优求解，获得最优超高压加工参数：处理压力为473.59MPa、处理时间为14.94min、保压温度为20℃，此时7项指标分别为：硬度2785g，弹性0.6711，内聚力0.2871，咀嚼度673.8；TBARS值0.6888mg/100g，感官评价16.16，保质期26.34d。
3 结 论
3.1 将响应曲面分析法中的Box-Behnken模式应用于清真牛肉香肠超高压处理参数的优化分析，建立并验证了各相应响应值的回归方程及其有效性。
3.2 数据表明：在处理压力、保压时间和处理温度是超高压处理影响清真牛肉香肠质构、感官评价、脂肪氧化及保质期的显著相应因子，分析表明在试验设计区间内，自变量因子的显著顺序为处理压力>保压时间>处理温度。 3.3 综合优化得出超高压处理清真牛肉香肠的最优工艺参数：处理压力473.59MPa、处理时间14.94min、保压温度20℃。在此条件下，得出香肠的各响应值：硬度2785g，弹性0.6711，内聚力0.2871，咀嚼度673.8；感官评价16.16，TBARS值0.6888mg/100g，保质期26.34d。
参考文献：
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[17] 中华人民共和国商务部. SB/T10279—2008 熏煮香肠[S]. 北京： 中国标准出版社， 2008.
[18] 中华人民共和国卫生部， 中国国家标准化管理委员会. GB 2726—2005 熟肉制品卫生标准[S]. 北京： 中国标准出版社， 2005.
[19] 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB4789.2—2010 菌落总数测定[S]. 北京： 中国标准出版社， 2010.
[20] 中国疾病预防控制中心营养与食品安全所. GB4789.3—2010 大肠菌群计数[S]. 北京： 中国标准出版社， 2010.
关键词：清真牛肉香肠；超高压；响应曲面法；质构分析；感官评价；脂肪氧化；保质期
中图分类号：TS251.1 文献标志码：A 文章编号：1001-8123（2013）11-0010-09
超高压作为一项新型非热加工技术，在肉制品低温杀菌和延长货架期[1-3]、钝化酶类[4-6]及改善感官品质[7-9]等方面显示出不可替代的优越性。由于该技术的作用机理是单纯的物理作用，能够最大程度地保持肉制品原有的色香味型[5]，对产品不会造成显著的影响[10]。目前，日本及欧美发达国家已实现了超高压加工产业化，并将其应用于肉制品加工中，如切片火腿、帕尔马火腿、西班牙风干火腿、色拉米香肠[11]、熟制鸡肉等[12]。
清真食品是中华传统饮食文化的一个重要组成部分，其中清真牛肉香肠是其中消费量最大的一种。目前该类香肠主要按照西式低温熏煮香肠的加工方式生产[13]，但是由于在加工过程中热处理水平较低，在包装过程中容易被二次污染[14]，在真空包装且有冷链保藏的条件下，2周左右也会出现腐败的现象[15]。
本实验为探索超高压在熏煮香肠加工方面的应用，采用不同压力、时间和温度的组合处理清真牛肉香肠，通过响应曲面法进行试验设计，研究超高压处理对清真牛肉香肠的感官品质、脂肪氧化及保质期的影响，并优化超高压加工技术参数，为实际生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
清真牛肉香肠配方（kg）：牛肉80、鸡皮20、味精0.3、食盐2.2、亚硝酸钠0.008、异抗坏血酸钠0.1、磷酸盐0.4、白糖2、香辛料0.4、红曲0.3、淀粉5、大豆分离蛋白4、冰水40。
牛肉小黄瓜条购于北京御香苑集团公司；其他辅料均市购。
三氯乙酸、三氯甲烷、氯化钠均为分析纯 北京化学试剂公司；乙二胺四乙酸二钠（生物技术级） 美国Amresco公司；2-硫代巴比妥酸（生化试剂） 国药集团化学试剂有限公司；平板计数琼脂培养基（生物试剂） 北京双旋微生物培养基制品厂；月桂基硫酸盐胰蛋白胨、煌绿乳糖胆盐、结晶紫中性红胆盐琼脂均为生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司。
1.2 仪器与设备
ABM-2组织粉碎机 日本日精株式会社；SCR20BC高速冷冻离心机 日本日立公司；UV/VIS-2800分光光度计 尤尼柯（上海）有限公司；TA.XT plus质构仪 英国Stable Micro System公司；HZQ-X100振荡培养箱 哈尔滨东明医疗仪器厂；HPP600/15L高压处理设备 包头科发新型高技术食品机械有限责任公司；LA2-3A1生物安全柜 新加坡ESCO公司。
1.3 方法
1.3.1 工艺流程
原料修整→滚揉→绞碎→配料→斩拌乳化→灌肠→烟熏蒸煮→冷却→真空包装。
每根香肠（40±5）g，采用胶原蛋白肠衣，每包5根，真空包装袋为聚酰胺/聚乙烯，20℃下包装袋的透氧率为24cm3/（m2·d）。样品制备后在4℃条件下贮藏备用。
1.3.2 样品高压处理
根据设计，将样品在20～60℃条件下分别以200～600MPa处理5～25min，处理时间不包括升、卸压时间。传压介质为水，水温由温控系统控制，升压速度为4MPa/min，降压为瞬时卸压，保压期间波动压力不大于5%，处理结束后，样品于4℃条件下冷却备用。每组样品设3个平行肉样，并设控制组样品。
1.3.3 质构分析
测定使用物性测试仪进行，测定方法采用质构剖面分析法（texture profile analysis，TPA）。参数设置：测试前速度2.0mm/s、测试速度1.0mm/s、测试后速度1.0mm/s、样品压缩比75%、两次压缩中停顿时间为5s，探头类型P50，样品规格1.5cm高的圆柱体，测定时环境温度25℃。测定结果取硬度、弹性、内聚力、咀嚼度4个指标。
1.3.4 脂肪氧化的测定
采用硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS）法检测[16]。称取10g样品，用组织破碎机充分绞碎后，置于100mL三角烧瓶中，加入50mL质量浓度为7.5g/100mL三氯乙酸溶液（含有质量浓度为0.1g/100mL乙二胺四乙酸二钠），在4℃条件下振摇30min。所得样液经双层滤纸过滤2次，取5mL滤液与5mL 0.02mol/L的2-硫代巴比妥酸溶液混合于50mL离心管中，混合液在90℃水浴条件下保持40min，取出后以流水冷却至室温。混合液5000×g离心5min，取5mL上清液与5mL三氯甲烷混合振荡，待样品分层后，取上层有机相进行在532nm和600nm处进行比色，记录吸光度。每个样品设3个平行样测定，TBARS值按照以下公式计算：
式中：TBARS为硫代巴比妥酸还原值/（mg/100g）；A532及A600分别为丙二醛与2-硫代巴比妥酸的反应产物在532nm和600nm处的最大和最小吸光度；155为丙二醛在532nm处的毫摩尔消光系数。 1.3.5 感官评定
本实验感官评定按照SB/T10279—2008《熏煮香肠》[17]进行，采用双盲法进行检验，即对样品进行密码随机编号（本研究采用3位随机数字）。评定分数采用1～7分制，1分最低，7分最高。每次评定由每个评定人员单独进行不同样品评定之间用温水漱口。感官指标包括：外观、色泽、组织状态、风味。
1.3.6 保质期测定
保质期为样品在4℃低温条件下，其微生物指标符合国标GB 2726—2005《熟肉制品卫生标准》[18]相关规定的保藏时间。具体操作方法参考国标GB4789.2—2010《菌落总数测定》[19]和GB4789.3—2010《大肠菌群计数》[20]进行。
1.4 响应曲面法试验设计
采用Box-Behnken 三因素三水平的响应曲面设计方法，以处理压力、保压时间和处理温度3个因子为自变量，分别表示为x1、x2、x3，确定各试验因子取值范围为200～600MPa、5～25min和20～60℃，分别以X1、X2、X3来表示，并以1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平，按方程xi=（Xi-X0）/ΔX对自变量进行编码，其中xi为自变量的编码值，Xi为自变量的真实值，X0为试验中心点处自变量的真实值，ΔX为自变量的变化步长，试验中自变量因素编码及水平见表1。
以超高压处理清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、脂肪氧化、感官评价及保质期为响应值（Yn），分别进行二次多项回归方程拟合及优化分析，预测模型响应值由最小二乘法拟合的二次多项方程表示：
Yn=B0+B1x1+B2x2+B3x3+B12x1x2+B13x1x3+B23x2x3+B11x12+B22x22+B33x32
式中：Yn为各检测项目的响应值，B0为常数项；B1、B2、B3分别为线性系数；B13、B13、B23分别为交互项系数；B11、B22、B33为二次项系数，需进行至少17组试验来求得各响应值方程的各项系数。
1.5 数据处理及分析
采用统计软件Design Expert V8.0.6（Stat-Ease Inc.， Minneapolis， MN， USA.）进行试验设计与数据分析。
2 结果与分析
2.1 响应曲面法优化试验的设计方案与试验结果
采用统计软件Design Expert进行设计并优化出的17组试验安排以及试验结果见表2。
2.2 回归模型建立、方差分析及系数显著性分析
采用统计软件Design Expert对表2试验数据进行二元回归拟合，分别获得硬度（Y1）、弹性（Y2）、内聚力（Y3）、咀嚼度（Y4）、脂肪氧化（Y5）、感官评价（Y6）及保质期（Y7）对编码自变量处理压力、保压时间和处理温度的二次多项式模型方程：
从回归模型方程系数显著性检验表4中可知，一次项x1（压力）、x2（时间）、x3（温度）对于清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、脂肪氧化、感官评价及保质期的影响均极显著（P<0.0001）；二次项x12对清真牛肉香肠的硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、感官评价的影响极显著（P<0.01），对脂肪氧化的影响显著（P<0.05），x22对各指标的影响均极显著（P<0.01），x32对于清真牛肉香肠的弹性、咀嚼度、脂肪氧化的影响均极显著（P<0.01），对内聚力的影响显著（P<0.05）；交互项x1x2对清真牛肉香肠的弹性、内聚力、脂肪氧化及保质期的影响均极显著（P<0.01），对硬度、咀嚼度和感官评价的影响显著（P<0.05），x1x3对清真牛肉香肠的硬度、弹性、脂肪氧化的影响极显著（P<0.01），对内聚力、咀嚼度、感官评价、保质期的影响显著（P<0.05），x2x3对清真牛肉香肠的咀嚼度和保质期的影响显著（P<0.05）。
2.3 超高压处理清真牛肉香肠质构的响应面分析
2.3.1 超高压处理清真牛肉香肠硬度的响应面分析
2.3.2 超高压处理清真牛肉香肠弹性的响应面分析
通过对以上响应曲面的分析可知，超高压处理能够有效地延长清真牛肉香肠的微生物保质期，改善香肠的质构指标，但会促进产品的脂肪氧化，对感官品质的影响也逐渐增强。其中处理压力是影响清真牛肉香肠质构、脂肪氧化和保质期的最主要因素，其后为保压时间和温度。对于质构分析中硬度和内聚力的影响，都呈现逐渐下降的趋势，而弹性和咀嚼度则呈现先降后升的情况。随着压力、时间和温度的升高，保质期明显延长，由此也导致脂肪氧化的加剧和感官品质的恶化。通过Design Expert统计软件分别对质构、感官评价、脂肪氧化及保质期进行分析，在600MPa、18min和34.19℃条件下，质构分析中的4个指标达到最好的状态；在597.15MPa、24.94min和33.44℃条件下，保质期可达到47.21d；在200MPa、5min和40℃条件下，TBARS值为0.4371mg/100g；在201.40MPa、5.85min和22.82℃条件下，感官评价达到19.45。对清真牛肉香肠的试验结果进行硬度、弹性、内聚力、咀嚼度、TBARS值、感官评价和保质期等7项指标联合最优求解，获得最优超高压加工参数：处理压力为473.59MPa、处理时间为14.94min、保压温度为20℃，此时7项指标分别为：硬度2785g，弹性0.6711，内聚力0.2871，咀嚼度673.8；TBARS值0.6888mg/100g，感官评价16.16，保质期26.34d。
3 结 论
3.1 将响应曲面分析法中的Box-Behnken模式应用于清真牛肉香肠超高压处理参数的优化分析，建立并验证了各相应响应值的回归方程及其有效性。
3.2 数据表明：在处理压力、保压时间和处理温度是超高压处理影响清真牛肉香肠质构、感官评价、脂肪氧化及保质期的显著相应因子，分析表明在试验设计区间内，自变量因子的显著顺序为处理压力>保压时间>处理温度。 3.3 综合优化得出超高压处理清真牛肉香肠的最优工艺参数：处理压力473.59MPa、处理时间14.94min、保压温度20℃。在此条件下，得出香肠的各响应值：硬度2785g，弹性0.6711，内聚力0.2871，咀嚼度673.8；感官评价16.16，TBARS值0.6888mg/100g，保质期26.34d。
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