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【中图分类号】R773【文献标识码】A【文章编号】1632-5281（2015）3
[摘要] 目的 研究槲皮素对体外培养宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法 MTT法和细胞克隆形成法检测槲皮素对宫颈癌细胞增殖的影响；流式细胞法检测细胞凋亡及周期分布；Transwell法检测细胞体外侵袭力的改变。结果 经不同浓度槲皮素处理后，宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力明显受到抑制，凋亡率显著增高，呈量效关系；随着槲皮素浓度升高。结论 槲皮素可对体外培养宫颈癌细胞产生抑制增殖、诱导凋亡、降低侵袭和转移等作用。
[关键词] 槲皮素； 宫颈癌；增殖；凋亡
槲皮素是一种具有多种生物学活性的黄酮类化合物，广泛分布于多种植物的根、茎、叶、花及果实
中。研究显示，槲皮素具有抗氧化、抗炎症、抗过敏、抗菌、抗病毒等多种功效，可起到降血压、降血脂、扩张冠状动脉及抗心律失常等作用[1 ]。近年来，槲皮素的抗肿瘤作用逐渐引起了人们的重视，有望开发成一种抗肿瘤新药[2]，目前，有关槲皮素抗宫颈癌方面的研究多集中于对其增殖的影响[3]，而对其复发、转移及其它生物学行为影响的报道却较少，本文对此进行了研究。
1材料与方法
1.1试剂与仪器 槲皮素、二甲基亚砜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma产品； Transwell小室购自美国Costar公司； Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2实验方法
1.2.1 MTT法检测细胞增殖 取指数生长期宫颈癌Hela细胞接种于96孔板，培养24h后吸出原培养液，加入含不同浓度槲皮素的RPMI1640培养基，使每孔终浓度分别为0、30、60、90、120、150μmol/L，每组设5个复孔，继续培养24、48、72h后，每孔加入20μL MTT，继续培养4h后甩掉各孔液体，每孔加入150μL DMSO，振摇10min后上酶标仪在562nm波长处测吸光度值，代入公式计算抑制率，增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD度）/对照组OD值╳100%。
1.2.2细胞克隆法检测细胞增殖 参照文献配制半固体培养基，消化收集经0、30、60、90、120μmol/L 槲皮素作用48h的各组细胞，PBS清洗， 1000rpm离心3min，用含20%小牛血清培养液稀释成7.0×103个/ml单细胞悬液，于24孔板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0ml/孔，加入单细胞悬液50?l，使每孔细胞数为350个，每个浓度设5个复孔，混匀后置37℃，5%CO2培养箱中孵育12～14d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率（给药组平均克隆数/未给药组平均克隆数×100%），实验重复三次。
1.2.3流式法检测细胞周期及凋亡 细胞分组及处理同1.2.3，收集经0、30、60、90、120μmol/L 槲皮素处理48h的各组细胞各1×106个，PBS洗2次，加入70%冷乙醇充分混匀固定细胞，置4℃冰箱过夜，
基金项目： 湖北医药学院2014年校级大学生创新训练项目2014XS01； 十堰市科技局项目14Y33
作者简介：朱勤勤，唐文勋，储俊，庹明辉， 葛亭，均为湖北医药学院第三临床学院2011级临床本科学生。
*通讯作者：邓守恒，湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心教授，主要从事肿瘤药理研究。
加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase 2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭性改变 细胞分组及处理同1.2.3，以NIH3T3细胞培养液做趋化液，在上室内加入100μl不含小牛血清的RPMI1640培养基，37℃孵育1h，加入上述各组细胞悬液20μl，每组4个复孔。37℃ 12h后取出滤膜，甲醇固定，HE染色。显微镜下计数滤膜外表面的细胞数，实验重复三次，以相对侵袭抑制率表示肿瘤细胞的侵袭力，相对侵袭抑制率（%）=（对照组-实验组）/对照组×100%。
1.2.5统计学处理 数据以 ±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行one-way ANOVA方差检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 槲皮素对细胞增殖的抑制作用 0、30、60、90、120、150μmol/L等6个浓度的槲皮素分别作用于体外培养的Hela细胞24、48、72h，可对细胞增殖产生明显的抑制作用，呈现出一定的时间和剂量依赖关系。作用24、48、72h的半数抑制浓度IC50分别为118.2、81.7、50.4μmol/L。
2.2 槲皮素对细胞周期分布、凋亡率的影响 在2.1筛选结果基础上，采用30、60、90、120μmol/L 槲皮素处理Hela细胞48h用于检测细胞凋亡及周期分布改变，结果显示，未经药物作用的空白对照细胞凋亡率很低，仅为（2.8±0.2）%，经30-120μmol/L槲皮素作用48h，细胞凋亡率明显升高（P<0.05，P<0.01）。细胞周期分析结果显示，60μmol/L及以上浓度的槲皮素能够降低G0/G1期细胞比例，升高G2/M期细胞比例，药物剂量越大作用效果越明显（P<0.05，P<0.01）。
2.3 槲皮素对细胞存活率及侵袭力的影响 30、60、90、120μmol/L 槲皮素作用Hela细胞48h可明显抑制细胞克隆形成，使细胞存活率显著下降， 槲皮素浓度越高作用效果越明显（P<0.05，P<0.01）。细胞侵袭实验也显示出相似的作用结果，槲皮素作用后的细胞侵袭人工基底膜后，细胞在数量上明显减少，药物浓度越高，对细胞侵袭抑制率越强（P<0.05，P<0.01）。
3讨论
本文中，笔者将槲皮素作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞株，采用MTT法和克隆形成法共同检测了其对细胞增殖的影响，结果发现，槲皮素可明显抑制细胞增殖，且呈一定的时效和量效关系。由于克隆形成实验反映的是单个细胞的增殖能力，这表明槲皮素不仅对处于增殖期的细胞有抑制杀伤作用，还可对肿瘤干细胞产生明显的增殖抑制作用。
肿瘤侵袭转移是指位于原发灶的肿瘤细胞脱落，随循环移动后与血管、淋巴管内皮细胞黏附、进而侵袭穿过内皮细胞及其基底膜定植形成转移灶，是恶性肿瘤的另一生物学行为。笔者的研究结果显示槲皮素对宫颈癌细胞的侵袭转移也可产生明显的抑制作用，表现为经槲皮素作用后的肿瘤细胞穿过基底膜的能力大大下降，数量明显减少。
参考文献
[1]Scambia Gpanici P， B Raneuetti F，O. Quercetin enhance transforming growth factorβsecretion by human ovanrian cancer cells[J]. Int J Cancer， 1994，54（57）：211-215.
[摘要] 目的 研究槲皮素对体外培养宫颈癌细胞增殖、凋亡和侵袭的影响。方法 MTT法和细胞克隆形成法检测槲皮素对宫颈癌细胞增殖的影响；流式细胞法检测细胞凋亡及周期分布；Transwell法检测细胞体外侵袭力的改变。结果 经不同浓度槲皮素处理后，宫颈癌细胞的增殖和侵袭能力明显受到抑制，凋亡率显著增高，呈量效关系；随着槲皮素浓度升高。结论 槲皮素可对体外培养宫颈癌细胞产生抑制增殖、诱导凋亡、降低侵袭和转移等作用。
[关键词] 槲皮素； 宫颈癌；增殖；凋亡
槲皮素是一种具有多种生物学活性的黄酮类化合物，广泛分布于多种植物的根、茎、叶、花及果实
中。研究显示，槲皮素具有抗氧化、抗炎症、抗过敏、抗菌、抗病毒等多种功效，可起到降血压、降血脂、扩张冠状动脉及抗心律失常等作用[1 ]。近年来，槲皮素的抗肿瘤作用逐渐引起了人们的重视，有望开发成一种抗肿瘤新药[2]，目前，有关槲皮素抗宫颈癌方面的研究多集中于对其增殖的影响[3]，而对其复发、转移及其它生物学行为影响的报道却较少，本文对此进行了研究。
1材料与方法
1.1试剂与仪器 槲皮素、二甲基亚砜、四甲基偶氮唑蓝（MTT）为美国Sigma产品； Transwell小室购自美国Costar公司； Mod 550型全自动酶标仪（美国Bio-Rad公司）。
1.2实验方法
1.2.1 MTT法检测细胞增殖 取指数生长期宫颈癌Hela细胞接种于96孔板，培养24h后吸出原培养液，加入含不同浓度槲皮素的RPMI1640培养基，使每孔终浓度分别为0、30、60、90、120、150μmol/L，每组设5个复孔，继续培养24、48、72h后，每孔加入20μL MTT，继续培养4h后甩掉各孔液体，每孔加入150μL DMSO，振摇10min后上酶标仪在562nm波长处测吸光度值，代入公式计算抑制率，增殖抑制率=（对照组OD值-实验组OD度）/对照组OD值╳100%。
1.2.2细胞克隆法检测细胞增殖 参照文献配制半固体培养基，消化收集经0、30、60、90、120μmol/L 槲皮素作用48h的各组细胞，PBS清洗， 1000rpm离心3min，用含20%小牛血清培养液稀释成7.0×103个/ml单细胞悬液，于24孔板预加1.2%甲基纤维素培养基1.0ml/孔，加入单细胞悬液50?l，使每孔细胞数为350个，每个浓度设5个复孔，混匀后置37℃，5%CO2培养箱中孵育12～14d后于倒置显微镜下计数细胞克隆数，计算细胞存活率（给药组平均克隆数/未给药组平均克隆数×100%），实验重复三次。
1.2.3流式法检测细胞周期及凋亡 细胞分组及处理同1.2.3，收集经0、30、60、90、120μmol/L 槲皮素处理48h的各组细胞各1×106个，PBS洗2次，加入70%冷乙醇充分混匀固定细胞，置4℃冰箱过夜，
基金项目： 湖北医药学院2014年校级大学生创新训练项目2014XS01； 十堰市科技局项目14Y33
作者简介：朱勤勤，唐文勋，储俊，庹明辉， 葛亭，均为湖北医药学院第三临床学院2011级临床本科学生。
*通讯作者：邓守恒，湖北医药学院附属人民医院肿瘤中心教授，主要从事肿瘤药理研究。
加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase 2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.2.4 Transwell法检测细胞侵袭性改变 细胞分组及处理同1.2.3，以NIH3T3细胞培养液做趋化液，在上室内加入100μl不含小牛血清的RPMI1640培养基，37℃孵育1h，加入上述各组细胞悬液20μl，每组4个复孔。37℃ 12h后取出滤膜，甲醇固定，HE染色。显微镜下计数滤膜外表面的细胞数，实验重复三次，以相对侵袭抑制率表示肿瘤细胞的侵袭力，相对侵袭抑制率（%）=（对照组-实验组）/对照组×100%。
1.2.5统计学处理 数据以 ±s表示，应用SPSS 17.0统计软件进行one-way ANOVA方差检验，p<0.05为差异具有统计学意义。
2结果
2.1 槲皮素对细胞增殖的抑制作用 0、30、60、90、120、150μmol/L等6个浓度的槲皮素分别作用于体外培养的Hela细胞24、48、72h，可对细胞增殖产生明显的抑制作用，呈现出一定的时间和剂量依赖关系。作用24、48、72h的半数抑制浓度IC50分别为118.2、81.7、50.4μmol/L。
2.2 槲皮素对细胞周期分布、凋亡率的影响 在2.1筛选结果基础上，采用30、60、90、120μmol/L 槲皮素处理Hela细胞48h用于检测细胞凋亡及周期分布改变，结果显示，未经药物作用的空白对照细胞凋亡率很低，仅为（2.8±0.2）%，经30-120μmol/L槲皮素作用48h，细胞凋亡率明显升高（P<0.05，P<0.01）。细胞周期分析结果显示，60μmol/L及以上浓度的槲皮素能够降低G0/G1期细胞比例，升高G2/M期细胞比例，药物剂量越大作用效果越明显（P<0.05，P<0.01）。
2.3 槲皮素对细胞存活率及侵袭力的影响 30、60、90、120μmol/L 槲皮素作用Hela细胞48h可明显抑制细胞克隆形成，使细胞存活率显著下降， 槲皮素浓度越高作用效果越明显（P<0.05，P<0.01）。细胞侵袭实验也显示出相似的作用结果，槲皮素作用后的细胞侵袭人工基底膜后，细胞在数量上明显减少，药物浓度越高，对细胞侵袭抑制率越强（P<0.05，P<0.01）。
3讨论
本文中，笔者将槲皮素作用于体外培养的宫颈癌Hela细胞株，采用MTT法和克隆形成法共同检测了其对细胞增殖的影响，结果发现，槲皮素可明显抑制细胞增殖，且呈一定的时效和量效关系。由于克隆形成实验反映的是单个细胞的增殖能力，这表明槲皮素不仅对处于增殖期的细胞有抑制杀伤作用，还可对肿瘤干细胞产生明显的增殖抑制作用。
肿瘤侵袭转移是指位于原发灶的肿瘤细胞脱落，随循环移动后与血管、淋巴管内皮细胞黏附、进而侵袭穿过内皮细胞及其基底膜定植形成转移灶，是恶性肿瘤的另一生物学行为。笔者的研究结果显示槲皮素对宫颈癌细胞的侵袭转移也可产生明显的抑制作用，表现为经槲皮素作用后的肿瘤细胞穿过基底膜的能力大大下降，数量明显减少。
参考文献
[1]Scambia Gpanici P， B Raneuetti F，O. Quercetin enhance transforming growth factorβsecretion by human ovanrian cancer cells[J]. Int J Cancer， 1994，54（57）：211-215.