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摘 要：随着分子生物学的不断发展，在模式植物拟南芥中初步探索分析基因功能的方法日渐成熟。为了探索棉花GhERF14基因的功能，构建过表达载体，通过转基因技术转入拟南芥中，通过筛选纯化获得纯合体转基因植株，观察表型，发现GhERF14基因对拟南芥的生长状况有一定的抑制作用，初步分析基因的功能为后续研究奠定一定的基础。
关键词：拟南芥;GhERF14基因;功能验证
1 材料
野生型、拟南芥大肠杆菌感受态DH5α、农杆菌菌株GV3101，植物过表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS（含KnptⅡ基因）由本实验室保存。
2 试验方法
2.1 拟南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14过表达载体的构建
过表达载体在试验前期已经构建好的目的基因与带有35S的过表达载体连接即可，方法可参照目的基因与PMD19-T的连接方法。
2.2 电击法转化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF
14重组质粒转移到农杆菌GV3101
将验证好的质粒利用电击的方法转入农杆菌GV3101中。
2.3 拟南芥侵染液配制
将含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒的农杆菌新鲜菌液1‰加入含有50 mg/L的Kan、50 mg/L的Rif的新鲜灭菌LB液体培养基中，置于28 ℃、200 rpm的恒温摇床30～36 h，直至菌液呈橘黄色，菌液OD600值为0.6左右为止。缓冲液配置500 mL体系：MS Medium 1.185 g、蔗糖25 g、Swillter-77 150μL、乙酰丁香酮（AS）500μL。4 ℃，5 000 g离心沉淀摇好的菌液，弃上清，用配制好的缓冲液在冰上悬浮，直至OD600值为0.5左右为止[1]。
2.4 拟南芥的侵染
利用农杆菌介导法转化拟南芥，取已经盛开的拟南芥植株，用剪刀去除果荚和花败的花，将花蕾浸泡于已经配制好的侵染液中，花蕾充分接触侵染液，时间不超过1 min，对侵染结束的植株进行遮光处理24 h，温度为23 ℃。每间隔5～7 d侵染1次，直至拟南芥生育期结束，收取拟南芥T0代种子，去除杂质，放于37 ℃恒温烘箱中24 h后进行筛选鉴定。
2.5 拟南芥DNA的提取以及PCR检验
取适量的新鲜拟南芥叶片，利用无菌研钵在液氮中研磨，然后根据Magen公司生产的植物DNA提取试剂盒的说明书进行，对提取的拟南芥DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，对DNA质量好的模板进行PCR检验[2]。
2.6 转基因拟南芥的生长状况调查
将转基因拟南芥与野生型拟南芥在温度、光照、湿度相同的生长环境下进行培养，观察转基因植株和野生型植株在苗期、抽薹期、成熟期的生长状况。
3 结果与分析
3.1 拟南芥的遗传转化及阳性植株筛选
将验证正确的含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14的农杆菌GV3101，利用农杆菌介导法转化拟南芥，对T0代种子进行50 mg/L浓度的Kan检验收取阳性植株，对T1、T2、T3植株单株收取种子，并对T1代植株叶片提取DNA，进行PCR凝胶电泳检测[3]。
3.2 拟南芥转基因植株表观形态
在T1代分别选择2个株系进行单株收种，然后分别在相同的环境下种植并进行筛选纯化，分别以T2-1、T2-2作为标记。转基因拟南芥植株与野生型相比苗期生长较慢，生育期延后当野生型抽薹后，T2-1、T2-2才刚刚长满叶，通过对比T2-1、T2-2发现：T2-1相比T2-2长势更弱、更慢。推断这可能与农杆菌侵染的染色体的部位不同部分有关，T2-1植株长势最慢，可能是A、D染色体同时被侵染，双供体侵染，具体原因还有待进一步探究。可以看出该基因可能与植株的生长发育有一定的关系。
当转基因株系开始抽薹时，野生型株系已经接近成熟，野生型株系比转基因T2-2提前15 d。对比T2-1、T2-2株系，T2-2株系明显比T2-1生长得快，当T2-2株系抽薹后4 d，T2-1才刚刚开始抽薹。可以看出，棉花GhERF14不仅影响棉花的生长，甚至会推迟生育期[4]。
转基因拟南芥盛花结荚时与野生型相比，其生育期晚了15～20 d。当转基因株系与野生型株系都接近成熟时，野生型的株高和植株分枝情况都大于转基因株系。同时转基因株系T2-1与T2-2相比也比较弱，分枝更少，T2-1长势更弱，分枝少，说明棉花GhERF14严重影响了植株的生长发育和分枝状况。
4 讨论与小结
通过观察转基因植株与野生型生长状况和生长势的差别发现，转基因植株长势比较弱，生育期延后。植物抗病防御反应的调控是非常复杂的，有许多转录因子家族扮演着重要的角色，对后续试验有一定的借鉴意义。
通过该试验发现，该基因不仅可以调控植株对枯萎病菌的抗性，还具有调控植株生长发育的作用，但是针对拟南芥中是否对枯萎病有响应还有待探究，为该基因在生物学功能方面的研究奠定了基础，有利于下一步试验的开展，对后续试验有一定的借鉴意义。
参考文献：
[ 1 ] Concatenate Luis，Anderson Jonathan P，Young Jodi，et al.AtERF14，a member of the ERF family of transcription factors，plays a nonredundant role in plant defense[J].Plant Physio-logy，2006，143（1）.
[ 2 ] 趙曾强.棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D].石河子：石河子大学， 2015.
[ 3 ] Singh K， Foley R C， Oate-Sánchez L. Transcription factorsin plant defense and stress responses[J].Curr.opin.plant Biol，2002，5（5）：430.
[ 4 ] Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plantgenes responsive to pathogens[J].Current Opinion in PlantBiology，1998，1（4）：311.
关键词：拟南芥;GhERF14基因;功能验证
1 材料
野生型、拟南芥大肠杆菌感受态DH5α、农杆菌菌株GV3101，植物过表达载体pCAMBIA2300-35S-OCS（含KnptⅡ基因）由本实验室保存。
2 试验方法
2.1 拟南芥pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14过表达载体的构建
过表达载体在试验前期已经构建好的目的基因与带有35S的过表达载体连接即可，方法可参照目的基因与PMD19-T的连接方法。
2.2 电击法转化pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF
14重组质粒转移到农杆菌GV3101
将验证好的质粒利用电击的方法转入农杆菌GV3101中。
2.3 拟南芥侵染液配制
将含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14重组质粒的农杆菌新鲜菌液1‰加入含有50 mg/L的Kan、50 mg/L的Rif的新鲜灭菌LB液体培养基中，置于28 ℃、200 rpm的恒温摇床30～36 h，直至菌液呈橘黄色，菌液OD600值为0.6左右为止。缓冲液配置500 mL体系：MS Medium 1.185 g、蔗糖25 g、Swillter-77 150μL、乙酰丁香酮（AS）500μL。4 ℃，5 000 g离心沉淀摇好的菌液，弃上清，用配制好的缓冲液在冰上悬浮，直至OD600值为0.5左右为止[1]。
2.4 拟南芥的侵染
利用农杆菌介导法转化拟南芥，取已经盛开的拟南芥植株，用剪刀去除果荚和花败的花，将花蕾浸泡于已经配制好的侵染液中，花蕾充分接触侵染液，时间不超过1 min，对侵染结束的植株进行遮光处理24 h，温度为23 ℃。每间隔5～7 d侵染1次，直至拟南芥生育期结束，收取拟南芥T0代种子，去除杂质，放于37 ℃恒温烘箱中24 h后进行筛选鉴定。
2.5 拟南芥DNA的提取以及PCR检验
取适量的新鲜拟南芥叶片，利用无菌研钵在液氮中研磨，然后根据Magen公司生产的植物DNA提取试剂盒的说明书进行，对提取的拟南芥DNA进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，对DNA质量好的模板进行PCR检验[2]。
2.6 转基因拟南芥的生长状况调查
将转基因拟南芥与野生型拟南芥在温度、光照、湿度相同的生长环境下进行培养，观察转基因植株和野生型植株在苗期、抽薹期、成熟期的生长状况。
3 结果与分析
3.1 拟南芥的遗传转化及阳性植株筛选
将验证正确的含有pCAMBIA2300-35S-OCS-GhERF14的农杆菌GV3101，利用农杆菌介导法转化拟南芥，对T0代种子进行50 mg/L浓度的Kan检验收取阳性植株，对T1、T2、T3植株单株收取种子，并对T1代植株叶片提取DNA，进行PCR凝胶电泳检测[3]。
3.2 拟南芥转基因植株表观形态
在T1代分别选择2个株系进行单株收种，然后分别在相同的环境下种植并进行筛选纯化，分别以T2-1、T2-2作为标记。转基因拟南芥植株与野生型相比苗期生长较慢，生育期延后当野生型抽薹后，T2-1、T2-2才刚刚长满叶，通过对比T2-1、T2-2发现：T2-1相比T2-2长势更弱、更慢。推断这可能与农杆菌侵染的染色体的部位不同部分有关，T2-1植株长势最慢，可能是A、D染色体同时被侵染，双供体侵染，具体原因还有待进一步探究。可以看出该基因可能与植株的生长发育有一定的关系。
当转基因株系开始抽薹时，野生型株系已经接近成熟，野生型株系比转基因T2-2提前15 d。对比T2-1、T2-2株系，T2-2株系明显比T2-1生长得快，当T2-2株系抽薹后4 d，T2-1才刚刚开始抽薹。可以看出，棉花GhERF14不仅影响棉花的生长，甚至会推迟生育期[4]。
转基因拟南芥盛花结荚时与野生型相比，其生育期晚了15～20 d。当转基因株系与野生型株系都接近成熟时，野生型的株高和植株分枝情况都大于转基因株系。同时转基因株系T2-1与T2-2相比也比较弱，分枝更少，T2-1长势更弱，分枝少，说明棉花GhERF14严重影响了植株的生长发育和分枝状况。
4 讨论与小结
通过观察转基因植株与野生型生长状况和生长势的差别发现，转基因植株长势比较弱，生育期延后。植物抗病防御反应的调控是非常复杂的，有许多转录因子家族扮演着重要的角色，对后续试验有一定的借鉴意义。
通过该试验发现，该基因不仅可以调控植株对枯萎病菌的抗性，还具有调控植株生长发育的作用，但是针对拟南芥中是否对枯萎病有响应还有待探究，为该基因在生物学功能方面的研究奠定了基础，有利于下一步试验的开展，对后续试验有一定的借鉴意义。
参考文献：
[ 1 ] Concatenate Luis，Anderson Jonathan P，Young Jodi，et al.AtERF14，a member of the ERF family of transcription factors，plays a nonredundant role in plant defense[J].Plant Physio-logy，2006，143（1）.
[ 2 ] 趙曾强.棉花GhWRKY44和GhWRKY22基因的克隆及功能初步分析[D].石河子：石河子大学， 2015.
[ 3 ] Singh K， Foley R C， Oate-Sánchez L. Transcription factorsin plant defense and stress responses[J].Curr.opin.plant Biol，2002，5（5）：430.
[ 4 ] Rushton P J，Somssich I E.Transcriptional control of plantgenes responsive to pathogens[J].Current Opinion in PlantBiology，1998，1（4）：311.