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摘要：为了研究牦牛杂交雄性不育的分子机制，采用3′-RACE方法分别从牦牛、黄牛睾丸组织的总RNA中获取其Prdm9基因的部分cDNA序列，长度分别为1 548、1 392 bp，包含全部的锌指域。对比分析显示：牦牛、黄牛的Prdm9基因均含有5个连续的C2H2型锌指，每个锌指均由21个氨基酸构成，锌指间是高度保守序列TGEKPYV，并且锌指域从这段高度保守序列开始；牦牛、黄牛各自Prdm9基因中的5个锌指间在氨基酸构成上存在差异，并且二者在整个锌指域上有6个氨基酸差异，其中5个都在锌指中的重要正向选择位点处，推测这些氨基酸差异可能与牦牛种间杂交后代的雄性不育有关。
关键词：牦牛；黄牛；杂交雄性不育；睾丸；Prdm9基因
中图分类号： S823.8+52；S823.8+12 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0028-02
收稿日期：2013-12-11
基金项目：国家自然科学基金（编号：31240053）；中央高校基本科研业务费资助课题（编号：12NZYTH06），西南民族大学研究生创新型科研项目（编号：CX2013SZ55）。
作者简介：马晓琴（1987—），女，甘肃武威人，硕士，主要从事动物生物化学与分子遗传学研究。E-mail：maxiaoqin1987@hotmail.com。
通信作者：郑玉才（1965—），男，内蒙古海拉尔人，博士，教授，主要从事牦牛的研究。E-mail：yucaizheng65@hotmail.com。牦牛（Bos grunniens）主要分布在我国海拔3 km以上的青藏高原，是该地区主要的家畜。牦牛与普通牛（Bos taurus）的种间杂交后代称犏牛，犏牛虽然具有明显的杂种优势，但却表现为雄性不育，犏牛雄性不育的缺陷制约了其杂种优势的利用，但是其机理尚不清楚。在杂交雄性不育的机制研究方面，20世纪70年代就发现了杂交不育-1（hybrid sterility-1，hst1）基因，2009年证实该基因就是Prdm9（PR domain containing 9）。Prdm9是催化组蛋白H3的4位赖氨酸发生三甲基化修饰的甲基转移酶，该基因不但是人类、小鼠减数分裂期重要转录调控因子和重组热点定位的主控因子，而且是迄今为止报道的唯一与哺乳动物杂种不育相关的基因[1-3]。PRDM9蛋白能够通过其高度重复的锌指域结合特定DNA序列，从而使结合该蛋白较多的区域成为同源重组热点区域[4]。Prdm9基因可限制家鼠亚种之间的杂交，敲出、插入或缺失1个锌指都可导致小鼠的杂交不育[2]。Prdm9基因只在雌、雄性小鼠进入减数分裂前期的生殖细胞内表达[3]，其发现为研究杂交不育提供了新的思路。本研究对牦牛、黄牛Prdm9基因的锌指域cDNA序列进行克隆和序列比对分析，以期为揭示牦牛种间杂交后代雄性不育的机制提供参考资料。
1材料与方法
1.1样品的采集
于2012年11月在四川省青白江象牙牛市选择健康的成年麦洼公牦牛（4～6岁，n=3）和公黄牛（4～6岁，n=3）。屠宰后30 min内迅速取出其睾丸组织并浸入RNAlater溶液中，冰浴条件下带回实验室，用于提取RNA。
1.2试剂与仪器
主要试剂包括：TRIzol、RNAlater，购自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 试剂盒，购自TaKaRa公司。引物的合成与测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
主要仪器包括：PowerPac 3000电泳仪，Bio-Rad公司；Versa Doc1000凝胶成像系统；WPA Biowave核酸蛋白检测仪；Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR仪。
1.3睾丸组织总RNA的提取
参照TRIzol试剂（Invitrogen公司）的产品说明书，从牦牛、黄牛的睾丸组织中提取总RNA，用WPA Biowave核酸蛋白检测仪测定提取的RNA浓度和纯度。
1.4牦牛、黄牛Prdm9基因锌指序列的克隆测序与分析
采用3′-RACE方法扩增牦牛、黄牛Prdm9基因的锌指序列。先使用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 试剂盒反转录3′-RACE的cDNA第一条链，然后再进行3′-RACE PCR扩增，技术流程和操作方法参照说明书。根据牦牛的Prdm9 mRNA的部分序列（GenBank登录号：JX454531），用Primer Premier 5.0软件设计特异上游引物（Prdm9-F1：TGCTCTCTGGCCTTCTCCAGTCAGAAGTTC），匹配试剂盒自带的下游引物，分别扩增牦牛、黄牛的Prdm9基因锌指序列。PCR程序为：95 ℃ 3.5 min；95 ℃ 30 s，68 ℃ 3.5 min，38个循环；72 ℃ 8 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒纯化回收特异条带。将回收的DNA片段与载体pMD19-T连接，再转化到宿主大肠杆菌DH5α中进行克隆，最后分别挑选4个牦牛、黄牛的阳性克隆，送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序。测序的结果采用Primer Premier 50软件翻译成氨基酸，再用DNAMAN软件进行比对分析。
2结果与分析
2.1牦牛、黄牛Prdm9基因部分序列的扩增
经检测，提取的RNA纯度和浓度达到了RACE扩增要求。由图1可见，用3′-RACE法分别从牦牛、黄牛睾丸组织中获得了约1 500、1 400 bp的特异扩增条带。测序结果表明，这2个条带为Prdm9基因的部分片段，长度分别为1 548、1 392 bp。 2.2牦牛、黄牛Prdm9基因锌指序列分析
由图2可知，对比分析牦牛、黄牛的Prdm9锌指域序列发现，它们是含有5个连续的C2H2型锌指，每个锌指有21个氨基酸。还可以看出，与普通牛预测的锌指结构一样，牦牛、黄牛的锌指间是保守序列“TGEKPYV”，并且锌指域从这个保守序列开始。由表1还可以看出，牦牛、黄牛不仅在各自的5个锌指间的氨基酸种类上存在差异，而且在整个锌指域的4个锌指中有6处氨基酸不同，这些差异的氨基酸在性质上有很大不同。
3结论与讨论
本试验通过对牦牛、黄牛Prdm9基因锌指域的克隆与分析，发现了一些重要的氨基酸差异，为进一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基础，期望能够为深入研究牦牛杂交雄性不育的分子机制提供参考资料。
参考文献：
[1]Baudat F，Buard J，Grey C，et al. PRDM9 is a major determinant of meiotic recombination hotspots in humans and mice[J]. Science，2010，327（5967）：836-840.
[2]Mihola O，Trachtulec Z，Vlcek C，et al. A mouse speciation gene encodes a meiotic histone H3 methyltransferase[J]. Science，2009，323（5912）：373-375.
[3]Hayashi K，Yoshida K，Matsui Y. A histone H3 methyltransferase controls epigenetic events required for meiotic prophase[J]. Nature，2005，438（766）：374-378.
[4]Grey C，Barthès P，Chauveau-Le Friec G，et al. Mouse PRDM9 DNA-binding specificity determines sites of histone H3 lysine 4 trimethylation for initiation of meiotic recombination[J]. PLoS Biology，2011，9（10）：e1001176.
[5]Li L，He S H，Sun J M，et al. Gene regulation by Sp1 and Sp3[J]. Biochemistry and Cell Biology，2004，82（4）：460-471.
[6]Lee J A，Suh D C，Kang J E，et al. Transcriptional activity of Sp1 is regulated by molecular interactions between the Zinc finger DNA binding domain and the inhibitory domain with corepressors，and this interaction is modulated by MEK[J]. Biological Chemistry，2005，280（30）：28061-28071.
[7]郭晓强. PRDM9在哺乳动物基因重组热点中的作用[J]. 生物化学与生物物理进展，2010，37（9）：929-931.
[8]Parvanov E D，Petkov P M，Paigen K. Prdm9 controls activation of mammalian recombination hotspots[J]. Science，2010，327（5967）：835.
[9]Thomas J H，Emerson R O，Shendure J. Extraordinary molecular evolution in the PRDM9 fertility gene[J]. PLoS One，2009，4（12）：e8505.
[10]Laity J H，Chung J，Dyson H J，et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor protein modulates DNA binding activity through isoform-specific DNA-induced conformational changes[J]. Biochemistry，2000，39（18）：5341-5348.
[11]Oliver P L，Goodstadt L，Bayes J J，et al. Accelerated evolution of the Prdm9 speciation gene across diverse metazoan taxa[J]. PLoS Genetics，2009，5（12）：e1000753.
[12]Irie S，Tsujimura A，Miyagawa Y，et al. Single-nucleotide polymorphisms of the PRDM9（MEISETZ） gene in patients with nonobstructive azoospermia[J]. Journal of Andrology，2009，30（4）：426-431.
关键词：牦牛；黄牛；杂交雄性不育；睾丸；Prdm9基因
中图分类号： S823.8+52；S823.8+12 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0028-02
收稿日期：2013-12-11
基金项目：国家自然科学基金（编号：31240053）；中央高校基本科研业务费资助课题（编号：12NZYTH06），西南民族大学研究生创新型科研项目（编号：CX2013SZ55）。
作者简介：马晓琴（1987—），女，甘肃武威人，硕士，主要从事动物生物化学与分子遗传学研究。E-mail：maxiaoqin1987@hotmail.com。
通信作者：郑玉才（1965—），男，内蒙古海拉尔人，博士，教授，主要从事牦牛的研究。E-mail：yucaizheng65@hotmail.com。牦牛（Bos grunniens）主要分布在我国海拔3 km以上的青藏高原，是该地区主要的家畜。牦牛与普通牛（Bos taurus）的种间杂交后代称犏牛，犏牛虽然具有明显的杂种优势，但却表现为雄性不育，犏牛雄性不育的缺陷制约了其杂种优势的利用，但是其机理尚不清楚。在杂交雄性不育的机制研究方面，20世纪70年代就发现了杂交不育-1（hybrid sterility-1，hst1）基因，2009年证实该基因就是Prdm9（PR domain containing 9）。Prdm9是催化组蛋白H3的4位赖氨酸发生三甲基化修饰的甲基转移酶，该基因不但是人类、小鼠减数分裂期重要转录调控因子和重组热点定位的主控因子，而且是迄今为止报道的唯一与哺乳动物杂种不育相关的基因[1-3]。PRDM9蛋白能够通过其高度重复的锌指域结合特定DNA序列，从而使结合该蛋白较多的区域成为同源重组热点区域[4]。Prdm9基因可限制家鼠亚种之间的杂交，敲出、插入或缺失1个锌指都可导致小鼠的杂交不育[2]。Prdm9基因只在雌、雄性小鼠进入减数分裂前期的生殖细胞内表达[3]，其发现为研究杂交不育提供了新的思路。本研究对牦牛、黄牛Prdm9基因的锌指域cDNA序列进行克隆和序列比对分析，以期为揭示牦牛种间杂交后代雄性不育的机制提供参考资料。
1材料与方法
1.1样品的采集
于2012年11月在四川省青白江象牙牛市选择健康的成年麦洼公牦牛（4～6岁，n=3）和公黄牛（4～6岁，n=3）。屠宰后30 min内迅速取出其睾丸组织并浸入RNAlater溶液中，冰浴条件下带回实验室，用于提取RNA。
1.2试剂与仪器
主要试剂包括：TRIzol、RNAlater，购自Invitrogen公司；3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 试剂盒，购自TaKaRa公司。引物的合成与测序均由上海生工生物工程有限公司完成。
主要仪器包括：PowerPac 3000电泳仪，Bio-Rad公司；Versa Doc1000凝胶成像系统；WPA Biowave核酸蛋白检测仪；Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR仪。
1.3睾丸组织总RNA的提取
参照TRIzol试剂（Invitrogen公司）的产品说明书，从牦牛、黄牛的睾丸组织中提取总RNA，用WPA Biowave核酸蛋白检测仪测定提取的RNA浓度和纯度。
1.4牦牛、黄牛Prdm9基因锌指序列的克隆测序与分析
采用3′-RACE方法扩增牦牛、黄牛Prdm9基因的锌指序列。先使用3′-Full RACE Core Set Ver. 2.0 试剂盒反转录3′-RACE的cDNA第一条链，然后再进行3′-RACE PCR扩增，技术流程和操作方法参照说明书。根据牦牛的Prdm9 mRNA的部分序列（GenBank登录号：JX454531），用Primer Premier 5.0软件设计特异上游引物（Prdm9-F1：TGCTCTCTGGCCTTCTCCAGTCAGAAGTTC），匹配试剂盒自带的下游引物，分别扩增牦牛、黄牛的Prdm9基因锌指序列。PCR程序为：95 ℃ 3.5 min；95 ℃ 30 s，68 ℃ 3.5 min，38个循环；72 ℃ 8 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，然后用胶回收试剂盒纯化回收特异条带。将回收的DNA片段与载体pMD19-T连接，再转化到宿主大肠杆菌DH5α中进行克隆，最后分别挑选4个牦牛、黄牛的阳性克隆，送至上海生工生物工程有限公司进行双向测序。测序的结果采用Primer Premier 50软件翻译成氨基酸，再用DNAMAN软件进行比对分析。
2结果与分析
2.1牦牛、黄牛Prdm9基因部分序列的扩增
经检测，提取的RNA纯度和浓度达到了RACE扩增要求。由图1可见，用3′-RACE法分别从牦牛、黄牛睾丸组织中获得了约1 500、1 400 bp的特异扩增条带。测序结果表明，这2个条带为Prdm9基因的部分片段，长度分别为1 548、1 392 bp。 2.2牦牛、黄牛Prdm9基因锌指序列分析
由图2可知，对比分析牦牛、黄牛的Prdm9锌指域序列发现，它们是含有5个连续的C2H2型锌指，每个锌指有21个氨基酸。还可以看出，与普通牛预测的锌指结构一样，牦牛、黄牛的锌指间是保守序列“TGEKPYV”，并且锌指域从这个保守序列开始。由表1还可以看出，牦牛、黄牛不仅在各自的5个锌指间的氨基酸种类上存在差异，而且在整个锌指域的4个锌指中有6处氨基酸不同，这些差异的氨基酸在性质上有很大不同。
3结论与讨论
本试验通过对牦牛、黄牛Prdm9基因锌指域的克隆与分析，发现了一些重要的氨基酸差异，为进一步研究牦牛PRDM9的功能奠定了基础，期望能够为深入研究牦牛杂交雄性不育的分子机制提供参考资料。
参考文献：
[1]Baudat F，Buard J，Grey C，et al. PRDM9 is a major determinant of meiotic recombination hotspots in humans and mice[J]. Science，2010，327（5967）：836-840.
[2]Mihola O，Trachtulec Z，Vlcek C，et al. A mouse speciation gene encodes a meiotic histone H3 methyltransferase[J]. Science，2009，323（5912）：373-375.
[3]Hayashi K，Yoshida K，Matsui Y. A histone H3 methyltransferase controls epigenetic events required for meiotic prophase[J]. Nature，2005，438（766）：374-378.
[4]Grey C，Barthès P，Chauveau-Le Friec G，et al. Mouse PRDM9 DNA-binding specificity determines sites of histone H3 lysine 4 trimethylation for initiation of meiotic recombination[J]. PLoS Biology，2011，9（10）：e1001176.
[5]Li L，He S H，Sun J M，et al. Gene regulation by Sp1 and Sp3[J]. Biochemistry and Cell Biology，2004，82（4）：460-471.
[6]Lee J A，Suh D C，Kang J E，et al. Transcriptional activity of Sp1 is regulated by molecular interactions between the Zinc finger DNA binding domain and the inhibitory domain with corepressors，and this interaction is modulated by MEK[J]. Biological Chemistry，2005，280（30）：28061-28071.
[7]郭晓强. PRDM9在哺乳动物基因重组热点中的作用[J]. 生物化学与生物物理进展，2010，37（9）：929-931.
[8]Parvanov E D，Petkov P M，Paigen K. Prdm9 controls activation of mammalian recombination hotspots[J]. Science，2010，327（5967）：835.
[9]Thomas J H，Emerson R O，Shendure J. Extraordinary molecular evolution in the PRDM9 fertility gene[J]. PLoS One，2009，4（12）：e8505.
[10]Laity J H，Chung J，Dyson H J，et al. Alternative splicing of Wilms tumor suppressor protein modulates DNA binding activity through isoform-specific DNA-induced conformational changes[J]. Biochemistry，2000，39（18）：5341-5348.
[11]Oliver P L，Goodstadt L，Bayes J J，et al. Accelerated evolution of the Prdm9 speciation gene across diverse metazoan taxa[J]. PLoS Genetics，2009，5（12）：e1000753.
[12]Irie S，Tsujimura A，Miyagawa Y，et al. Single-nucleotide polymorphisms of the PRDM9（MEISETZ） gene in patients with nonobstructive azoospermia[J]. Journal of Andrology，2009，30（4）：426-431.