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摘要：目的 检测M-CSF（macrophage colony-stimulating factor）巨噬细胞集落刺激因子对1，25二羟基胆钙化醇（1，25（OH）2D3）诱导形成的破骨样细胞噬骨能力的影响。 方法 加入M-CSF及1，25二羟基胆钙化醇（1，25（OH）2D3）诱导该大鼠骨髓单核细胞生成破骨样细胞，对照组只加1，25二羟基胆钙化醇诱导该大鼠骨髓单核细胞生成破骨样细胞。用甲苯胺兰染色鉴定破骨细胞嗜骨能力。 结果 诱导破骨细胞TRAP 染色阳性。甲苯胺兰染色显示破骨样细胞在骨片上培养时产生一定面积及深度的骨陷凹。 结论M-CSF组形成的破骨样细胞在特异酶及噬骨能力与对照组无差异。
关键词：破骨细胞；培养；诱导；鉴定
中图分类号：R816.8 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）8-023-02
材料和方法
1 动物及药品
新生24 h Wistar大鼠（沈阳医学院动物部）， 1， 25 （ OH ） 2 D3 、胰蛋白酶、 萘酚AS-BI磷酸钠、酒石酸甲钠（Sigma）， DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（天津灏洋） ，EDTA，M-CSF（Sigma） 。
2 方法
2.1 薄骨磨片的制备及处理：
取新鲜成年牛股骨皮质-20℃贮存。使用前用钢锯锯成1 cm宽条后用磨片机磨成厚50μm的 1 cm×1 cm骨片 ，蒸馏水中清洗 10次 ，置于75%酒精中，侵泡24 h，自然晾干 ，在超净台内骨片两面紫外线照射消毒后放于DMEM 液中4℃备用。
2.2 M-CSF与1，25（OH）2D3诱导破骨样细胞的生成：
出生24 h内的新生大鼠断颈处死，无菌取其四肢长骨，在无菌PBS液中去净附着在其表面的软组织（尽可能去其所有组织）。将其骨干在DMEM培养基（含10%胎牛血清，4umol/L谷氨酰胺）中去除两干骺端，然后纵行剖开，刮骨髓腔内表面直至骨干成为极为微小的碎片，用300目筛网滤过，用吸管反复多次轻吹洗筛网上残渣，吸取滤过悬液置离心管内，4℃ 1000 r/min离心10 min，弃上清，加4 m1 DMEM培养液吹打均匀，接种于培养瓶中，37℃ CO2培养箱孵育20 h。轻吸取培养板中的培养液于离心管内，PBS液冲洗培养皿2遍，将洗涤下的液体也置于离心管内。0.05 %胰蛋白酶/0.02% EDTA联合消化培养皿内的细胞5 min，将消化下的细胞也置入上述离心管内。PBS液冲洗培养皿2遍，DMEM终止胰蛋白酶的作用。倒置相差显微镜观察，如残留的单核细胞较多可重复所有上述操作。将上述收集于离心管内的细胞，在4℃ 1000 r/min下离心10 min，弃上清，加适量DMEM培养基，调整细胞密度约2x106/ml左右，将细胞接种于24孔板中，其中24孔板内置1x1cm2骨片，使细胞接种密度为2 x 106/cm2。使含1，25（OH）2D3组终浓度为10-8M[4]。分成M-CSF组和对照组，M-CSF组中加M-CSF使其终浓度为20ng/ml，置37 ℃ 5 % CO2培养箱内培养。隔日换液1次。
2.3 骨吸收陷窝定量分析
2.3.1 骨片吸收陷窝记数：
参考高建军等方法[5]分别于3，6，9 d取出对照组和M-CSF组培养板中的骨片各四张，2.5%戊二醛固定7 min，与0.25mol/L氢氧化铵中超声波清洗5 minX3次，系列梯度酒精脱水，自然凉干，1%甲苯胺蓝染液室温染色3～4min，蒸馏水清洗，于100倍光镜下对整张骨片上的吸收陷窝记数。
2.3.2 吸收陷窝面积分析：
以上各组经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，采用计算机Meta Morph /Dp10 /Bx41分析系统勾画出骨陷窝轮廓，计算并比较各组陷窝面积。
2.3.3 吸收陷窝深度分析：
以上各组经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，由于陷窝着色深浅与其深度有关，采用计算机MetaMorph/Dp10 /Bx41分析系统分析计算各组骨片上陷窝染色的平均光密度值，并以此比较各组陷窝深度的差异。
2.4 统计学处理
结果以ˉX ±s 表示，所有数据采用SPSS 1110 软件进行，多组比较用one way ANOVA 方差分析，组间比较用q 检验；两组比较用t 检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。
结果
3.1吸收陷窝个数分析
从表3可以看出，随着培养时间的延长，对照组与M-CSF组陷窝深度逐渐扩大，在3d、6d、9d时，对照组与M-CSF组之间经双侧t检验分析（p>0.05），说明两组间吸收陷凹深度没有差异。
讨论
破骨细胞的分离培养见于80年代，1982年Chamber首次从乳兔四肢骨分离培养出成熟破骨细胞[1]，为骨吸收的体外研究奠定了基础。我国于世风等[2 ]1988年率先引进了破骨细胞的培养方法并加以改良[3 ]。后来发现用1， 25 （ OH ） 2 D3诱导单核细胞形成破骨样细胞。
大多数学者认为，破骨细胞属单核/巨噬细胞谱系细胞，受多种基本调控的细胞因子的直接或间接刺激作用，经增殖、分化、生存与融合发育为多核的成熟破骨细胞，最后被活化[6]。最新的理论认为，在诸多调节破骨细胞分化和形成及其骨吸收的因素中，能直接作用于破骨细胞的只有一对既相互促进又相互制约的偶联因子—破骨细胞分化因子（RANKL/ODF/OPGL/TRANCE）和破骨细胞形成抑制因子暨护骨素（OPG/OCIF）[7，8]。它们与破骨细胞膜上的RANK一道构成一个三因子系统。该系统在骨代谢的调节中具有极其重要的作用。调节破骨细胞分化、形成和吸收的众多因子如PTH1α、1，25-（OH）2D3、IL等都是直接作用于成骨细胞，调节这两个因子的浓度增加与减少，进而间接地完成它们的调节功能。 而1 ，25 （OH） 2D3 被证明是一种很强的骨吸收刺激因子，是维生素D 受体通路的代表因子，参与破骨细胞的形成及激活过程。目前国内所用的大鼠骨髓源性破骨细胞培养，主要以1 ，25 （OH） 2D3作为诱导物[5 ，6 ] 。由于骨髓干细胞1 ，25 （OH） 2D3 诱导培养体系需要成骨细胞支持，造成破骨细胞分离纯化困难，所以这种方法比较适用于研究破骨细胞分化发育过程中细胞因子的调节作用，而不适合用于对细胞纯度要求较高的破骨细胞分泌蛋白检测、生化和分子生物研究。
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）也称为集落刺激因子-1（CSF-1），是一种具有谱系特异性的细胞因子。M-CSF为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，主要存在于骨髓腔内，对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要作用。其受体为c-Fms。M-CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子，具有促进破骨细胞对骨吸收的作用。M-CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统。HaynesDR等研究发现，在单核细胞和成骨细胞的体外共同培养系中，伴随着破骨细胞的形成，出现M-CSF高表达；如果阻断M-CSF与其受体的结合，可显著减少破骨细胞的数目。M-CSF调节破骨细胞活性骨骼形成之后即处于不断的成骨破骨的动态平衡中，破骨细胞的骨吸收活性维持并促进骨的更新与生长。成骨细胞合成和分泌的M-CSF不仅诱导破骨细胞的形成，对调节骨吸收活性也有重要作用。在小鼠骨髓/脾细胞和成骨/基质细胞体外共培养系统中，1，25（OH）2D3和Dex等钙调节因子可激活成骨/基质细胞生成大量的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），后者作用于前破骨细胞，从而诱导这些细胞的增殖和分化。M-CSF已被证实是破骨细胞生成的必要条件。此外，Lacey DL等在实验中还观察到，经M-CSF诱导的骨髓培养细胞中可形成大量能被OPGL结合的细胞，这些细胞形态类似前破骨细胞，体外可经诱导形成具有吸收功能的成熟破骨细胞。
参考文献：巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的研究进展
医药科学综合> 《现代医学》> 2004年6月32卷3期>论著> 文章详情 巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究
参考文献：
[1]Chambers TJ， Magnus CL. Calcitanin alters behavior of isolated osteoclasts[J]. J Pathol，1982，136（ I ） ：27-39.
[2]史风芹，于世风，庞椒珍，等.鸡破骨细胞分离培养方法的建立.中国骨质疏松杂志[J].1995，1（2）：101-103.
[3]李斌斌，于世风，庞淑珍.两种破骨细胞培养方法的比较及其吸收骨质的动态观察[J].北京大学学报.2005，37（5）：536-541.
[4]朱敏，张鹏，王张鑫，等.骨片上培养的破骨细胞样细胞及其对成骨细胞影响的实验研究[J].中华医学杂志.2005，85（11）：738-742
[5]高建军，金慰芳，王洪复. 骨片吸收陷凹光镜计数法定量测定破骨细胞功能[J]. 上海医科大学，1998，25（1）：71-73
[6]伍贤平，廖二元.破骨细胞及其调节机制的某些进展.中华内分泌代谢杂志[J]，2002，18（2）：157-160
[7]Gangji V，Hauzeur JP，Scboutens A，et al.Abnormalities in the replicative capacity of osteoblastic cells in the proximal femur of patients with osteonecrosis of the femoral head[J]. J Rhenmatol，2003，30（2）：348-351
[8] 杨旭，杨庆铭，邓廉夫.重组人骨保护素对体外培养兔破骨细胞的影响[J].2003，23（6）：365-368
[9]Tezuka K， Sato T， Kamioka H， et al. Identification of oeteopontin in iso-laced rabbit osteoclasts[J]. Biochem and Biophy Rea Common， 1992， 186（2）：911-917.
[10]张鲲，陈晓亮，王德春等. 两种方法培养大鼠破骨细胞的比较研究.中国骨质疏松杂志[J].2006 ，12 （6 ）：561-601
关键词：破骨细胞；培养；诱导；鉴定
中图分类号：R816.8 文献标识码：A 文章编号：1005-0515（2013）8-023-02
材料和方法
1 动物及药品
新生24 h Wistar大鼠（沈阳医学院动物部）， 1， 25 （ OH ） 2 D3 、胰蛋白酶、 萘酚AS-BI磷酸钠、酒石酸甲钠（Sigma）， DMEM培养基（Gibco），胎牛血清（天津灏洋） ，EDTA，M-CSF（Sigma） 。
2 方法
2.1 薄骨磨片的制备及处理：
取新鲜成年牛股骨皮质-20℃贮存。使用前用钢锯锯成1 cm宽条后用磨片机磨成厚50μm的 1 cm×1 cm骨片 ，蒸馏水中清洗 10次 ，置于75%酒精中，侵泡24 h，自然晾干 ，在超净台内骨片两面紫外线照射消毒后放于DMEM 液中4℃备用。
2.2 M-CSF与1，25（OH）2D3诱导破骨样细胞的生成：
出生24 h内的新生大鼠断颈处死，无菌取其四肢长骨，在无菌PBS液中去净附着在其表面的软组织（尽可能去其所有组织）。将其骨干在DMEM培养基（含10%胎牛血清，4umol/L谷氨酰胺）中去除两干骺端，然后纵行剖开，刮骨髓腔内表面直至骨干成为极为微小的碎片，用300目筛网滤过，用吸管反复多次轻吹洗筛网上残渣，吸取滤过悬液置离心管内，4℃ 1000 r/min离心10 min，弃上清，加4 m1 DMEM培养液吹打均匀，接种于培养瓶中，37℃ CO2培养箱孵育20 h。轻吸取培养板中的培养液于离心管内，PBS液冲洗培养皿2遍，将洗涤下的液体也置于离心管内。0.05 %胰蛋白酶/0.02% EDTA联合消化培养皿内的细胞5 min，将消化下的细胞也置入上述离心管内。PBS液冲洗培养皿2遍，DMEM终止胰蛋白酶的作用。倒置相差显微镜观察，如残留的单核细胞较多可重复所有上述操作。将上述收集于离心管内的细胞，在4℃ 1000 r/min下离心10 min，弃上清，加适量DMEM培养基，调整细胞密度约2x106/ml左右，将细胞接种于24孔板中，其中24孔板内置1x1cm2骨片，使细胞接种密度为2 x 106/cm2。使含1，25（OH）2D3组终浓度为10-8M[4]。分成M-CSF组和对照组，M-CSF组中加M-CSF使其终浓度为20ng/ml，置37 ℃ 5 % CO2培养箱内培养。隔日换液1次。
2.3 骨吸收陷窝定量分析
2.3.1 骨片吸收陷窝记数：
参考高建军等方法[5]分别于3，6，9 d取出对照组和M-CSF组培养板中的骨片各四张，2.5%戊二醛固定7 min，与0.25mol/L氢氧化铵中超声波清洗5 minX3次，系列梯度酒精脱水，自然凉干，1%甲苯胺蓝染液室温染色3～4min，蒸馏水清洗，于100倍光镜下对整张骨片上的吸收陷窝记数。
2.3.2 吸收陷窝面积分析：
以上各组经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，采用计算机Meta Morph /Dp10 /Bx41分析系统勾画出骨陷窝轮廓，计算并比较各组陷窝面积。
2.3.3 吸收陷窝深度分析：
以上各组经甲苯胺蓝染色骨片于400倍光镜下随机选取5个视野拍摄照片，由于陷窝着色深浅与其深度有关，采用计算机MetaMorph/Dp10 /Bx41分析系统分析计算各组骨片上陷窝染色的平均光密度值，并以此比较各组陷窝深度的差异。
2.4 统计学处理
结果以ˉX ±s 表示，所有数据采用SPSS 1110 软件进行，多组比较用one way ANOVA 方差分析，组间比较用q 检验；两组比较用t 检验。P < 0.05 为差异有统计学意义。
结果
3.1吸收陷窝个数分析
从表3可以看出，随着培养时间的延长，对照组与M-CSF组陷窝深度逐渐扩大，在3d、6d、9d时，对照组与M-CSF组之间经双侧t检验分析（p>0.05），说明两组间吸收陷凹深度没有差异。
讨论
破骨细胞的分离培养见于80年代，1982年Chamber首次从乳兔四肢骨分离培养出成熟破骨细胞[1]，为骨吸收的体外研究奠定了基础。我国于世风等[2 ]1988年率先引进了破骨细胞的培养方法并加以改良[3 ]。后来发现用1， 25 （ OH ） 2 D3诱导单核细胞形成破骨样细胞。
大多数学者认为，破骨细胞属单核/巨噬细胞谱系细胞，受多种基本调控的细胞因子的直接或间接刺激作用，经增殖、分化、生存与融合发育为多核的成熟破骨细胞，最后被活化[6]。最新的理论认为，在诸多调节破骨细胞分化和形成及其骨吸收的因素中，能直接作用于破骨细胞的只有一对既相互促进又相互制约的偶联因子—破骨细胞分化因子（RANKL/ODF/OPGL/TRANCE）和破骨细胞形成抑制因子暨护骨素（OPG/OCIF）[7，8]。它们与破骨细胞膜上的RANK一道构成一个三因子系统。该系统在骨代谢的调节中具有极其重要的作用。调节破骨细胞分化、形成和吸收的众多因子如PTH1α、1，25-（OH）2D3、IL等都是直接作用于成骨细胞，调节这两个因子的浓度增加与减少，进而间接地完成它们的调节功能。 而1 ，25 （OH） 2D3 被证明是一种很强的骨吸收刺激因子，是维生素D 受体通路的代表因子，参与破骨细胞的形成及激活过程。目前国内所用的大鼠骨髓源性破骨细胞培养，主要以1 ，25 （OH） 2D3作为诱导物[5 ，6 ] 。由于骨髓干细胞1 ，25 （OH） 2D3 诱导培养体系需要成骨细胞支持，造成破骨细胞分离纯化困难，所以这种方法比较适用于研究破骨细胞分化发育过程中细胞因子的调节作用，而不适合用于对细胞纯度要求较高的破骨细胞分泌蛋白检测、生化和分子生物研究。
巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）也称为集落刺激因子-1（CSF-1），是一种具有谱系特异性的细胞因子。M-CSF为链间二硫键连接而成的二聚体糖蛋白，主要存在于骨髓腔内，对单核细胞的增殖、分化及维持其活性有重要作用。其受体为c-Fms。M-CSF是破骨细胞代谢过程中的关键因子，具有促进破骨细胞对骨吸收的作用。M-CSF对骨代谢的主要作用之一是上调破骨系统。HaynesDR等研究发现，在单核细胞和成骨细胞的体外共同培养系中，伴随着破骨细胞的形成，出现M-CSF高表达；如果阻断M-CSF与其受体的结合，可显著减少破骨细胞的数目。M-CSF调节破骨细胞活性骨骼形成之后即处于不断的成骨破骨的动态平衡中，破骨细胞的骨吸收活性维持并促进骨的更新与生长。成骨细胞合成和分泌的M-CSF不仅诱导破骨细胞的形成，对调节骨吸收活性也有重要作用。在小鼠骨髓/脾细胞和成骨/基质细胞体外共培养系统中，1，25（OH）2D3和Dex等钙调节因子可激活成骨/基质细胞生成大量的巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF），后者作用于前破骨细胞，从而诱导这些细胞的增殖和分化。M-CSF已被证实是破骨细胞生成的必要条件。此外，Lacey DL等在实验中还观察到，经M-CSF诱导的骨髓培养细胞中可形成大量能被OPGL结合的细胞，这些细胞形态类似前破骨细胞，体外可经诱导形成具有吸收功能的成熟破骨细胞。
参考文献：巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的研究进展
医药科学综合> 《现代医学》> 2004年6月32卷3期>论著> 文章详情 巨噬细胞集落刺激因子对破骨细胞生物作用的实验研究
参考文献：
[1]Chambers TJ， Magnus CL. Calcitanin alters behavior of isolated osteoclasts[J]. J Pathol，1982，136（ I ） ：27-39.
[2]史风芹，于世风，庞椒珍，等.鸡破骨细胞分离培养方法的建立.中国骨质疏松杂志[J].1995，1（2）：101-103.
[3]李斌斌，于世风，庞淑珍.两种破骨细胞培养方法的比较及其吸收骨质的动态观察[J].北京大学学报.2005，37（5）：536-541.
[4]朱敏，张鹏，王张鑫，等.骨片上培养的破骨细胞样细胞及其对成骨细胞影响的实验研究[J].中华医学杂志.2005，85（11）：738-742
[5]高建军，金慰芳，王洪复. 骨片吸收陷凹光镜计数法定量测定破骨细胞功能[J]. 上海医科大学，1998，25（1）：71-73
[6]伍贤平，廖二元.破骨细胞及其调节机制的某些进展.中华内分泌代谢杂志[J]，2002，18（2）：157-160
[7]Gangji V，Hauzeur JP，Scboutens A，et al.Abnormalities in the replicative capacity of osteoblastic cells in the proximal femur of patients with osteonecrosis of the femoral head[J]. J Rhenmatol，2003，30（2）：348-351
[8] 杨旭，杨庆铭，邓廉夫.重组人骨保护素对体外培养兔破骨细胞的影响[J].2003，23（6）：365-368
[9]Tezuka K， Sato T， Kamioka H， et al. Identification of oeteopontin in iso-laced rabbit osteoclasts[J]. Biochem and Biophy Rea Common， 1992， 186（2）：911-917.
[10]张鲲，陈晓亮，王德春等. 两种方法培养大鼠破骨细胞的比较研究.中国骨质疏松杂志[J].2006 ，12 （6 ）：561-601