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摘要：以徐筒玉丝瓜为试验材料，对丝瓜花粉先后分别进行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy等不同剂量的γ射线辐照处理，通过对处理后花粉活力的表现、坐果情况以及瓜内种子的比较，进行花粉辐照处理后的效应研究。结果表明，正常丝瓜的花粉活力为84.60%，授粉后坐果率为80%，经过γ射线辐照后花粉活力、坐果率显著降低，辐射剂量为250、400、500、750、1000Gy的处理，花粉活力变化幅度为45.19%～72.48%，坐果率变化幅度为10%～60%，且二者整体均呈现逐渐下降的趋势;在1000Gy以上的高剂量辐照下，花粉活力降为50%以下，授粉后均不能坐瓜。对老瓜内种子的比较发现，辐射剂量为250Gy处理时，种子外形饱满与正常种子表现一致，发芽率达到84.50%，与正常种子发芽率85.25%相比差异不显著;从400Gy处理开始，种子外形呈现干瘪空壳状且均不能萌发。研究结果表明，适合丝瓜辐射花粉授粉研究的剂量范围应该介于250～400Gy之间。本试验结果可为丝瓜辐射花粉诱导单倍体研究中花粉辐射剂量的选择提供相关依据。
关键词：花粉辐照;花粉活力;坐果率;发芽率
中图分类号：S642.401文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2020）22-0135-04
作者简介：王博（1994—），男，硕士研究生，研究方向为园艺作物栽培和育种。E-mail：2018804177@njau.edu.cn。
通信作者：钱春桃，教授，研究方向为园艺作物栽培和育种。E-mail：chuntaoq@njau.edu.cn。
丝瓜（LuffacylindricaRoem.）为1年生葫芦科丝瓜属作物，起源于亚洲热带地区，在全世界共有8个种，我国主要有普通丝瓜和有棱丝瓜2个栽培种，是我国常见瓜类蔬菜之一[1-3]。丝瓜生产规模的扩大对品种的培育提出了更高要求。目前，江苏省乃至全国的丝瓜主要是常规育种，周期长、效率不高，而利用双单倍体（doublehaploid，DH）进行育种可以缩短育种年限[4]。辐射花粉授粉和离体胚挽救技术是获得葫芦科作物双单倍体的主要途径之一[5]。
辐射花粉授粉是通过物理诱导的方法诱导植株体内的雌核发生，使未受精的胚囊细胞发育成胚，形成单倍体或双单倍体材料[4]。目前，辐射花粉技术培养单倍体已在黄瓜[6]、甜瓜[7]、西瓜[8]等葫芦科作物上广为研究，杨泗海对丝瓜离体雌核发育诱导单倍体的胚培养环节培养基的设计展开了研究[9]，但是丝瓜辐射花粉诱导单/双单倍体的研究目前尚未见报道。
本试验对于丝瓜辐射花粉剂量效应的探索是整个辐射花粉途径，是一项必要的诱导培育丝瓜单倍体研究的基础工作，为了高效诱导丝瓜单倍体，确定适宜的辐射剂量非常重要[10]。在已有的葫芦科作物黄瓜[6]、甜瓜[7]辐射花粉诱导单倍体的研究中，适宜的辐射剂量为200～350Gy。在甜瓜上，研究者一般设定的辐射剂量范围为150～2500Gy[11～15]，因此在本研究中设计了10个剂量处理，分别为250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy。
1材料与方法
1.1材料
试验在南京农业大学（常熟）新农村发展研究院4号大棚内进行。试验材料主要为徐筒玉丝瓜品种，于2019年春季3月中旬播种，采用电热温床育苗，4月1日定植于大棚内，定植后进行常规栽培管理。试验配套的器材用具主要包括用于保存花粉的防晒泡沫保温箱、冰盒、冰块等。
1.2方法
1.2.1辐射处理
试验于2019年6—8月进行，在苏州大学独墅湖校区906幢辐照中心进行，辐射前1d下午套雄花，辐射当天早晨取雄花置于冰盒中，分别进行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy的γ射线辐照处理，每个剂量处理时间均为60min。
1.2.2花粉活力测定
取辐射当天各个剂量的花粉，参照张琛等研究中利用TTC法进行活力测定的方法[16]设计花粉活力测定试验，具体操作步骤为：取各个剂量花粉少许放在干洁的载玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，并用清水作对照。置35℃恒温箱中，30min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。每片取3个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。
1.2.3辐射花粉授粉及性状统计
辐射当天下午套雌花，第2天早晨进行各个剂量辐射花粉的授粉工作，每个辐射剂量授10朵雌花，授粉后进行常规的栽培管理。至商品瓜时期即授粉后10d，对坐果率进行统计;授粉后50d，取得到的老瓜内种子进行形态观察以及种子的萌发率统计。种子的萌发率测定参照黄树苹等研究中丝瓜种子发芽率的测定方法[17]，具体操作步骤为：将各个辐射剂量处理的瓜内种子各挑出100粒，每个处理4次重复，起始采用50℃左右温水浸种15min，此后置于清水中浸泡12h，并且每间隔4h换1次清水，浸种结束后用毛巾包裹放在30℃恒温光照培养箱内进行催芽。催芽期间分别于早上和晚上将种子拿出透气并清洗毛巾和种子。数据统计方法：发芽率=8d内发芽种子数/供试种子数×100%。
2结果与分析
2.1不同辐射剂量对花粉活力的影响
从表1可以看出，花粉活力随着辐射剂量的增大整体呈现下降的態势，仅在500、1250、1500Gy下处理出现反常，对应的花粉活力出现相应小幅度回升。未经辐射的花粉活力很强，达84.60%，而经辐射过的花粉活力变化幅度在18.28%～72.48%之间，各个剂量的辐射花粉的活力均低于未经辐射的花粉，差异均达显著水平，说明辐射能够显著降低丝瓜的花粉活力。当辐射剂量为250、400、500、750Gy时，花粉活力均在50%以上;辐射剂量为1000、1250、1500、1600Gy的处理，花粉活力已降低至50%以下，当辐射剂量达到1750Gy时，花粉活力下降至22.83%，不足30%;当辐射剂量为2000Gy时，花粉活力降低至18.28%，不足20%，说明辐射会在一定程度上降低丝瓜的花粉活力，且剂量越大，降低的效应越明显。 2.2不同辐射剂量对坐果率的影响
从表2可以看出，正常授粉的丝瓜坐果率达到80%，辐射花粉授粉的丝瓜坐果率变化幅度在0～60%之间，比较而言，辐射花粉授粉的瓜坐果率均低于正常授粉的丝瓜，说明辐射花粉对丝瓜的坐果率有一定的影响。当辐射剂量为250、400、500、750、1000Gy时，坐果率依次下降，辐射剂量为1000Gy的处理，坐瓜率仅为10%，辐射剂量高于1000Gy均不能坐果。表明在一定辐射剂量范围内，辐射花粉授粉会使丝瓜的坐果率降低，且高剂量的辐射花粉授粉会严重影响丝瓜的坐果率。
2.3不同辐射剂量下老瓜内种子的比较
试验中辐射剂量高于1000Gy时均未能坐瓜，
[FK（W15][HT6H][JZ]表1不同辐射剂量下丝瓜的花粉活力并未得到种子，对其他辐射剂量得到种子的观察结果如图1所示，正常花粉授粉的瓜内种子为黑色种皮，种子饱满，外形呈椭圆状，辐射剂量为250Gy的处理与正常花粉授粉的瓜种子外观上与正常瓜种子相似，无明显差别（图1-a、图1-b）;辐射剂量为400、500、750、1000Gy的处理瓜内种子外观相似，均为椭圆状干瘪空壳的种子（图1-c、图1-d、图1-e、图1-f）。对这些得到的种子发芽率统计结果见表3。
从表3可以看出，正常授粉的瓜内种子发芽率为85.25%，辐射剂量为250Gy处理的发芽率为84.50%，二者之间差异不显著，而辐射剂量为400、500、750、1000Gy处理的瓜内种子均未能萌发。综合种子外观比较而言，250Gy的剂量处理下瓜内形成的种子为发芽率正常的丝瓜种子，而400Gy及以上的剂量处理瓜内形成的种子是干瘪空壳状、不能正常萌发的种子。
3讨论与结论
试验结果表明，辐射导致丝瓜花粉活力显著降低，且随着辐射剂量的增大，花粉活力降低得越明显，在本研究中1750、2000Gy高剂量处理的花粉活力降低至30%以下，这可能是由于辐射破坏了花粉细胞的内部结构[18]，从而导致花粉细胞活力降低，进而使得花粉表现出来的活力下降，试验结果表明，剂量越大，花粉活力越低，说明高剂量辐射给花粉细胞带来的伤害作用越明显。
从坐果情况来看，辐射花粉授粉后，坐果率相比正常丝瓜均降低，且剂量越大，坐果率越低，当辐射剂量超过1000Gy后丝瓜已很难坐果，这可能是由于辐射后花粉活力降低导致的。曾辉等研究认为，花粉活力与坐果率的高低直接相关[19]。在薛浩等关于甜瓜辐射花粉的研究结论中，辐射剂量在200～1500Gy时，对坐果率没有明显的影响;而在2000Gy时，坐果率明显降低[10]，本研究结果与之不完全一致，可能是由于试验材料的不同所致。Visser等认为，辐射剂量与植物的倍性、花粉粒的大小有关，倍性越高、花粉粒越小，越耐辐射[20-21]，对于丝瓜来说，其花粉粒比甜瓜要大，因此相比甜瓜不耐辐射，所以才会出现辐射后花粉活力、坐果率均显著降低的结果。
从收得的老瓜种子来看，250Gy的剂量辐照形成的种子在形态和萌发率上与正常种子相比均无较大差别，而400Gy及以上的剂量辐射形成的种子均为干瘪空壳，且这些种子均不能正常萌发，说明400Gy的剂量辐射已不足以使丝瓜形成正常种子，由此可推测适合丝瓜辐射花粉授粉研究的剂量范围应该在250～400Gy之间，本结论与张永兵等关于辐射花粉诱导甜瓜单倍体的研究中“适宜诱导培育单倍体剂量为300Gy”的结论[13]相似。今后将在250～400Gy之间设计更为精细的剂量筛选试验，并结合胚拯救技术，开展丝瓜单倍体的培育研究。
参考文献：
[1]舒迎澜.主要瓜类蔬菜栽培简史[J].中国农史，1998，17（3）：94-99.
[2]林珲，陈朝文，温庆放，等.丝瓜种质资源遗传多样性分析[J].分子植物育种，2017，15（9）：3759-3766.
[3]王青青，王天文，高安辉.丝瓜种质资源与育种研究进展[J].现代园艺，2019（21）：33-35.
[4]付文苑，唐兵，邓英，等.辐射花粉授粉诱导黄瓜单倍体及染色体加倍[J].分子植物育种，2019，17（21）：7150-7155.
[5]黄金华，董彦琪，刘喜存，等.葫芦科蔬菜单倍体育种技术研究进展——花粉辐射和离体胚挽救技术[J].中国瓜菜，2016，29（6）：1-4.
[6]雷春，陈劲枫，钱春桃，等.辐射花粉授粉和胚培养诱导产生黄瓜单倍体植株[J].西北植物学报，2004，24（9）：1739-1743.
[7]郭凤领，戴照义，邓晓辉，等.辐射花粉诱导甜瓜单倍体的研究[C]//园艺植物染色体倍性操作与遗传改良学术研讨会.重庆：中国园艺学会，2012.
[8]杨红，顾妍，张朝阳，等.辐射花粉授粉诱导西瓜单倍体[J].江苏农业科学，2017，45（22）：159-161.
[9]杨泗海.一种丝瓜未受精子房诱导培养基及诱导培养方法：CN201910725097.5[P].2019-09-27.
[10]薛皓，王建设，徐世才，等.甜瓜辐射花粉诱导单倍体的影响因素研究[J].长江蔬菜，2008（24）：7-10.
[11]LotfiM，AlanAR，HenningMJ，etal.Productionofhaploidanddoubledhaploidplantsofmelon（CucumismeloL.）foruseinbreedingformultiplevirusresistance[J].PlantCellReports，2003，21（11）：1121-1128.
[12]SautonA，deVaulxRD.Obtentiondeplantshaploidschezslemelon（CucumismeloL.）pargynogenesisinduitepardupollenirradie[J].Agronomie，1987（7）：141-148.
[13]张永兵，陈劲枫，伊鸿平，等.辐射花粉授粉诱导甜瓜单倍体[J].果树学报，2006，23（6）：892-895.
[14]CunyF，GrotteM，VaulxRD，etal.Effectsofgammairradiationofpollenonparthenogenetichaploidproductioninmuskmelon（CucumismeloL.）[J].EnvironmentalandExperimentalBotany，1993，33（2）：301-312.
[15]孙玉宏，梅时勇，彭金光，等.甜瓜胚抢救最佳时间的确定[J].长江蔬菜，2006（4）：43-44.
[16]张琛，郗笃隽，裴嘉博，等.时长和染色法对TTC法测定甜樱桃花粉活力的影响[J].杭州农业与科技，2019（5）：29-30.
[17]黄树苹，徐长城，谈杰，等.不同处理对鄂丝瓜1号种子萌发特性的影响[J].安徽农业科学，2015，43（2）：25-27.
[18]岳潔瑜.N 、α粒子、60Co-γ对陆地棉花粉的诱变效应研究及诱变后代鉴定[D].南京：南京农业大学，2010.
[19]曾辉，杨为海，林文秋，等.花粉活力对澳洲坚果初始坐果率的影响[J].热带作物学报，2018，39（1）：72-76.
[20]VisserT，OostEH.PollenandpollinationexperimentsⅢ.theviabilityofappleandpearpollenasaffectedbyirradiationandstorage[J].Euphytica，1981，30（1）：65-70.
[21]DenissenCM，NijsAD.EffectsofgammairradiationoninvitropollengerminationofdifferentCucumisspecies[J].Euphytica，1987，36（2）：651-658.
关键词：花粉辐照;花粉活力;坐果率;发芽率
中图分类号：S642.401文献标志码：A
文章编号：1002-1302（2020）22-0135-04
作者简介：王博（1994—），男，硕士研究生，研究方向为园艺作物栽培和育种。E-mail：2018804177@njau.edu.cn。
通信作者：钱春桃，教授，研究方向为园艺作物栽培和育种。E-mail：chuntaoq@njau.edu.cn。
丝瓜（LuffacylindricaRoem.）为1年生葫芦科丝瓜属作物，起源于亚洲热带地区，在全世界共有8个种，我国主要有普通丝瓜和有棱丝瓜2个栽培种，是我国常见瓜类蔬菜之一[1-3]。丝瓜生产规模的扩大对品种的培育提出了更高要求。目前，江苏省乃至全国的丝瓜主要是常规育种，周期长、效率不高，而利用双单倍体（doublehaploid，DH）进行育种可以缩短育种年限[4]。辐射花粉授粉和离体胚挽救技术是获得葫芦科作物双单倍体的主要途径之一[5]。
辐射花粉授粉是通过物理诱导的方法诱导植株体内的雌核发生，使未受精的胚囊细胞发育成胚，形成单倍体或双单倍体材料[4]。目前，辐射花粉技术培养单倍体已在黄瓜[6]、甜瓜[7]、西瓜[8]等葫芦科作物上广为研究，杨泗海对丝瓜离体雌核发育诱导单倍体的胚培养环节培养基的设计展开了研究[9]，但是丝瓜辐射花粉诱导单/双单倍体的研究目前尚未见报道。
本试验对于丝瓜辐射花粉剂量效应的探索是整个辐射花粉途径，是一项必要的诱导培育丝瓜单倍体研究的基础工作，为了高效诱导丝瓜单倍体，确定适宜的辐射剂量非常重要[10]。在已有的葫芦科作物黄瓜[6]、甜瓜[7]辐射花粉诱导单倍体的研究中，适宜的辐射剂量为200～350Gy。在甜瓜上，研究者一般设定的辐射剂量范围为150～2500Gy[11～15]，因此在本研究中设计了10个剂量处理，分别为250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy。
1材料与方法
1.1材料
试验在南京农业大学（常熟）新农村发展研究院4号大棚内进行。试验材料主要为徐筒玉丝瓜品种，于2019年春季3月中旬播种，采用电热温床育苗，4月1日定植于大棚内，定植后进行常规栽培管理。试验配套的器材用具主要包括用于保存花粉的防晒泡沫保温箱、冰盒、冰块等。
1.2方法
1.2.1辐射处理
试验于2019年6—8月进行，在苏州大学独墅湖校区906幢辐照中心进行，辐射前1d下午套雄花，辐射当天早晨取雄花置于冰盒中，分别进行250、400、500、750、1000、1250、1500、1600、1750、2000Gy的γ射线辐照处理，每个剂量处理时间均为60min。
1.2.2花粉活力测定
取辐射当天各个剂量的花粉，参照张琛等研究中利用TTC法进行活力测定的方法[16]设计花粉活力测定试验，具体操作步骤为：取各个剂量花粉少许放在干洁的载玻片上，加1～2滴0.5%TTC溶液，搅匀后盖上盖玻片，并用清水作对照。置35℃恒温箱中，30min后镜检，凡被染为红色的花粉活力强，淡红次之，无色者为没有活力或不育花粉。每片取3个视野，统计花粉的染色率，以染色率表示花粉的活力百分率。
1.2.3辐射花粉授粉及性状统计
辐射当天下午套雌花，第2天早晨进行各个剂量辐射花粉的授粉工作，每个辐射剂量授10朵雌花，授粉后进行常规的栽培管理。至商品瓜时期即授粉后10d，对坐果率进行统计;授粉后50d，取得到的老瓜内种子进行形态观察以及种子的萌发率统计。种子的萌发率测定参照黄树苹等研究中丝瓜种子发芽率的测定方法[17]，具体操作步骤为：将各个辐射剂量处理的瓜内种子各挑出100粒，每个处理4次重复，起始采用50℃左右温水浸种15min，此后置于清水中浸泡12h，并且每间隔4h换1次清水，浸种结束后用毛巾包裹放在30℃恒温光照培养箱内进行催芽。催芽期间分别于早上和晚上将种子拿出透气并清洗毛巾和种子。数据统计方法：发芽率=8d内发芽种子数/供试种子数×100%。
2结果与分析
2.1不同辐射剂量对花粉活力的影响
从表1可以看出，花粉活力随着辐射剂量的增大整体呈现下降的態势，仅在500、1250、1500Gy下处理出现反常，对应的花粉活力出现相应小幅度回升。未经辐射的花粉活力很强，达84.60%，而经辐射过的花粉活力变化幅度在18.28%～72.48%之间，各个剂量的辐射花粉的活力均低于未经辐射的花粉，差异均达显著水平，说明辐射能够显著降低丝瓜的花粉活力。当辐射剂量为250、400、500、750Gy时，花粉活力均在50%以上;辐射剂量为1000、1250、1500、1600Gy的处理，花粉活力已降低至50%以下，当辐射剂量达到1750Gy时，花粉活力下降至22.83%，不足30%;当辐射剂量为2000Gy时，花粉活力降低至18.28%，不足20%，说明辐射会在一定程度上降低丝瓜的花粉活力，且剂量越大，降低的效应越明显。 2.2不同辐射剂量对坐果率的影响
从表2可以看出，正常授粉的丝瓜坐果率达到80%，辐射花粉授粉的丝瓜坐果率变化幅度在0～60%之间，比较而言，辐射花粉授粉的瓜坐果率均低于正常授粉的丝瓜，说明辐射花粉对丝瓜的坐果率有一定的影响。当辐射剂量为250、400、500、750、1000Gy时，坐果率依次下降，辐射剂量为1000Gy的处理，坐瓜率仅为10%，辐射剂量高于1000Gy均不能坐果。表明在一定辐射剂量范围内，辐射花粉授粉会使丝瓜的坐果率降低，且高剂量的辐射花粉授粉会严重影响丝瓜的坐果率。
2.3不同辐射剂量下老瓜内种子的比较
试验中辐射剂量高于1000Gy时均未能坐瓜，
[FK（W15][HT6H][JZ]表1不同辐射剂量下丝瓜的花粉活力并未得到种子，对其他辐射剂量得到种子的观察结果如图1所示，正常花粉授粉的瓜内种子为黑色种皮，种子饱满，外形呈椭圆状，辐射剂量为250Gy的处理与正常花粉授粉的瓜种子外观上与正常瓜种子相似，无明显差别（图1-a、图1-b）;辐射剂量为400、500、750、1000Gy的处理瓜内种子外观相似，均为椭圆状干瘪空壳的种子（图1-c、图1-d、图1-e、图1-f）。对这些得到的种子发芽率统计结果见表3。
从表3可以看出，正常授粉的瓜内种子发芽率为85.25%，辐射剂量为250Gy处理的发芽率为84.50%，二者之间差异不显著，而辐射剂量为400、500、750、1000Gy处理的瓜内种子均未能萌发。综合种子外观比较而言，250Gy的剂量处理下瓜内形成的种子为发芽率正常的丝瓜种子，而400Gy及以上的剂量处理瓜内形成的种子是干瘪空壳状、不能正常萌发的种子。
3讨论与结论
试验结果表明，辐射导致丝瓜花粉活力显著降低，且随着辐射剂量的增大，花粉活力降低得越明显，在本研究中1750、2000Gy高剂量处理的花粉活力降低至30%以下，这可能是由于辐射破坏了花粉细胞的内部结构[18]，从而导致花粉细胞活力降低，进而使得花粉表现出来的活力下降，试验结果表明，剂量越大，花粉活力越低，说明高剂量辐射给花粉细胞带来的伤害作用越明显。
从坐果情况来看，辐射花粉授粉后，坐果率相比正常丝瓜均降低，且剂量越大，坐果率越低，当辐射剂量超过1000Gy后丝瓜已很难坐果，这可能是由于辐射后花粉活力降低导致的。曾辉等研究认为，花粉活力与坐果率的高低直接相关[19]。在薛浩等关于甜瓜辐射花粉的研究结论中，辐射剂量在200～1500Gy时，对坐果率没有明显的影响;而在2000Gy时，坐果率明显降低[10]，本研究结果与之不完全一致，可能是由于试验材料的不同所致。Visser等认为，辐射剂量与植物的倍性、花粉粒的大小有关，倍性越高、花粉粒越小，越耐辐射[20-21]，对于丝瓜来说，其花粉粒比甜瓜要大，因此相比甜瓜不耐辐射，所以才会出现辐射后花粉活力、坐果率均显著降低的结果。
从收得的老瓜种子来看，250Gy的剂量辐照形成的种子在形态和萌发率上与正常种子相比均无较大差别，而400Gy及以上的剂量辐射形成的种子均为干瘪空壳，且这些种子均不能正常萌发，说明400Gy的剂量辐射已不足以使丝瓜形成正常种子，由此可推测适合丝瓜辐射花粉授粉研究的剂量范围应该在250～400Gy之间，本结论与张永兵等关于辐射花粉诱导甜瓜单倍体的研究中“适宜诱导培育单倍体剂量为300Gy”的结论[13]相似。今后将在250～400Gy之间设计更为精细的剂量筛选试验，并结合胚拯救技术，开展丝瓜单倍体的培育研究。
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