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摘 要：文章首先介绍了注射用头炮曲松钠菌素无菌检查使用到的试验环境与材料，整理所用到的物质成分。其次重点介绍检查方法以及结果验证的要点技术，总结验证的整体流程。最后根据文章中列举的方法进行详细探讨，帮助提升工作任务完成质量。
关键词：头炮菌素；无菌检查；方法学验证
一、实验环境与材料
1、实验环境
注射用头孢菌素的无菌检验要求在环节洁净度为万级，并且局部的洁净度在百级的单向流空气的无菌室中进行。
2、仪器
对抗生素类药物的纯度进行检验时，需要借助仪器设备来完成，观察其中是否存在影响药物作用细菌，头孢曲松钠菌素中杂质检验需要达到一定量才会有结果显示。在工作任务开展期间，会选择部分药物原料，对其进行培养，如果其中存在其他物质也更方便观察。需要注意的是仪器与材料的选择。仪器选择合理是提升质量的关键，能够为培养环节提供合理的温度，除此之外技术人员也要及时记录指标的变化情况，以免出现最终数据结果的丢失，无法对检验环节进行评估。常用设备如下。
3、材料
JT 智能集菌仪（武汉奥斯特科技有限公司）、NKF330 一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、生化培养箱（SHP -250 型，上海精宏试验设备有限公司）、 霉菌培养箱（MJX -250B-Z 型，上海博迅实业有限公司）、 注射用头孢曲松钠（珠海联邦制药股份有限公司、规格：1. 0 g、批号：80401910）。
4、培养基、稀释液及缓冲液
第一，干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（批号：071122）、改良马丁培养基（批号：080311）、 改良马丁琼脂培养基（批号：090603）、营养琼脂培养基（批号：080304）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：071217），均由北京三药科技开发公司生产。
第二，細菌稀释液：0.9%灭菌氯化钠溶液（批号：090609），由福州市药品检验所菌检室配制。
第三，冲洗用缓冲液：pH 7.0 氯化钠―蛋白胨缓冲液（批号：090611），由福州市药品检验所菌检室配制。
二、方法与结果
1、对照菌液的制备
检验任务完成后，结果需要在对照下才能够准确的分析。因此需要对对照物质进行选择，要与所检测的物质在成分上保持一致。菌液量也是需要特别注意的，过多会造成浪费，同时量少也会对检测结果造成影响，不利于生产任务进行。下面将列举几种常见的对照菌液。分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7d，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（管口带有薄的无菌棉花过滤菌丝）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2、菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取金黄色葡萄球菌液、大肠埃希菌液、 枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液各1 ml，注入约15 ml、45℃营养琼脂平皿，经36 ℃生化培养箱培养24～48 h；白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1 ml，注入约15 ml、 45℃改良马丁琼脂平皿，经 26℃生化培养箱培养48～72 h，活菌计数。
3、无菌检查方法验证
分别将培养的试液与参照样品相比较，记录出结果上存在的误差，再根据记录的结果判断误差是否在合理范围内，如果存在严重的不合理现象，则要判断是否在培养中融入了其他物质，导致最终成分中出现其他物质。检验任务需要在无菌的操作环境下进行，工作人员严格执行规范标准，发现问题后及时与管理人员沟通，采取技术手段进行调节，以免最终结果对检验带来影响。试剂添加的先后顺序也是需要特别注意的，逐次滴进试管中，间隔时间也要达到规定标准，确保流程的严谨性。阳性对照组（菌液+培养基）：取一次性全封闭过滤器（三联）2套，2管分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml、4管分别泵入改良马丁培养基各100ml滤入相应集菌器，在阳性控制室内将少于100cfu的6种试验菌接种1ml于相应滤筒，作为阳性对照，分别置规定温度培养3～5天。阴性对照组（缓冲液+培养基）：取一次性全封闭过滤器（二联）1套，滤过适量缓冲液后分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基100ml、改良马丁培养基100ml，作为阴性对照组，分别置规定温度培养14天。试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
以上3组平行试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以300ml/筒的量冲洗，对枯草芽孢杆菌、生孢梭菌，白色念珠菌及黑曲霉无明显抑菌活性，均可使其正常生长，而对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性不能完全消除。因此缓冲液量增加为500ml/筒。
试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
4、样品的无菌检查
取样品15支依上述薄膜过滤法同法操作，按500ml/筒的缓冲液量冲洗，泵入细菌，真菌培养基后，按规定温度培养14天，逐日观察，样品组2管均澄清；阳性组2管泵入细菌培养基后分别接入金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，培养2天，生长良好；阴性对照2管培养14天均澄清；判定供试品符合规定。
三、讨论
注射剂作为药品的一种重要剂型被广泛地应用于临床，由于其直接注入人体体内，发挥疗效，因此其安全性显得尤为重要。无菌检查是体现灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的一个重要指标。无菌检查的目的既要保证标准规定的阳性对照菌正常生长，又要准确无误地检查样品染菌情况，所以当建立药品的无菌检查法时，对其进行验证以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查；并确认供试品在该试验条件下无抑菌活性是十分必要的。无菌检查采用薄膜过滤法是取样量较大的集菌方法，具有代表性，不易漏检，该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染。
该法运用的注意事项：（1）做无菌试验前必须进行培养基的适用性检查，培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，以确保初步环节可靠。（2）验证试验应在阳性试验室进行，而不能在供试品无菌检查的试验室中进行，以避免试验菌污染无菌检验的环境。
参考文献：
[1] 钱生稳，戴红娟，钱春江.注射用唑来膦酸无菌检查法方法学研究[J].海峡药学，2007， 19 （7）：46-48.
[2] 程浩.注射用头孢曲松钠无菌检查方法验证试验[J].科技致富向导，2015（01）.
关键词：头炮菌素；无菌检查；方法学验证
一、实验环境与材料
1、实验环境
注射用头孢菌素的无菌检验要求在环节洁净度为万级，并且局部的洁净度在百级的单向流空气的无菌室中进行。
2、仪器
对抗生素类药物的纯度进行检验时，需要借助仪器设备来完成，观察其中是否存在影响药物作用细菌，头孢曲松钠菌素中杂质检验需要达到一定量才会有结果显示。在工作任务开展期间，会选择部分药物原料，对其进行培养，如果其中存在其他物质也更方便观察。需要注意的是仪器与材料的选择。仪器选择合理是提升质量的关键，能够为培养环节提供合理的温度，除此之外技术人员也要及时记录指标的变化情况，以免出现最终数据结果的丢失，无法对检验环节进行评估。常用设备如下。
3、材料
JT 智能集菌仪（武汉奥斯特科技有限公司）、NKF330 一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）、生化培养箱（SHP -250 型，上海精宏试验设备有限公司）、 霉菌培养箱（MJX -250B-Z 型，上海博迅实业有限公司）、 注射用头孢曲松钠（珠海联邦制药股份有限公司、规格：1. 0 g、批号：80401910）。
4、培养基、稀释液及缓冲液
第一，干粉培养基：硫乙醇酸盐培养基（批号：071122）、改良马丁培养基（批号：080311）、 改良马丁琼脂培养基（批号：090603）、营养琼脂培养基（批号：080304）、玫瑰红钠琼脂培养基（批号：071217），均由北京三药科技开发公司生产。
第二，細菌稀释液：0.9%灭菌氯化钠溶液（批号：090609），由福州市药品检验所菌检室配制。
第三，冲洗用缓冲液：pH 7.0 氯化钠―蛋白胨缓冲液（批号：090611），由福州市药品检验所菌检室配制。
二、方法与结果
1、对照菌液的制备
检验任务完成后，结果需要在对照下才能够准确的分析。因此需要对对照物质进行选择，要与所检测的物质在成分上保持一致。菌液量也是需要特别注意的，过多会造成浪费，同时量少也会对检测结果造成影响，不利于生产任务进行。下面将列举几种常见的对照菌液。分别接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤中，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基，30～35℃培养18～24h；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中，23～28℃培养24～48h，上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液；接种黑曲霉菌的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23～28℃培养5～7d，加入3～5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液（管口带有薄的无菌棉花过滤菌丝）至无菌试管内，用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
2、菌液计数
每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取金黄色葡萄球菌液、大肠埃希菌液、 枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液各1 ml，注入约15 ml、45℃营养琼脂平皿，经36 ℃生化培养箱培养24～48 h；白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1 ml，注入约15 ml、 45℃改良马丁琼脂平皿，经 26℃生化培养箱培养48～72 h，活菌计数。
3、无菌检查方法验证
分别将培养的试液与参照样品相比较，记录出结果上存在的误差，再根据记录的结果判断误差是否在合理范围内，如果存在严重的不合理现象，则要判断是否在培养中融入了其他物质，导致最终成分中出现其他物质。检验任务需要在无菌的操作环境下进行，工作人员严格执行规范标准，发现问题后及时与管理人员沟通，采取技术手段进行调节，以免最终结果对检验带来影响。试剂添加的先后顺序也是需要特别注意的，逐次滴进试管中，间隔时间也要达到规定标准，确保流程的严谨性。阳性对照组（菌液+培养基）：取一次性全封闭过滤器（三联）2套，2管分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基各100ml、4管分别泵入改良马丁培养基各100ml滤入相应集菌器，在阳性控制室内将少于100cfu的6种试验菌接种1ml于相应滤筒，作为阳性对照，分别置规定温度培养3～5天。阴性对照组（缓冲液+培养基）：取一次性全封闭过滤器（二联）1套，滤过适量缓冲液后分别泵入硫乙醇酸盐流体培养基100ml、改良马丁培养基100ml，作为阴性对照组，分别置规定温度培养14天。试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
以上3组平行试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以300ml/筒的量冲洗，对枯草芽孢杆菌、生孢梭菌，白色念珠菌及黑曲霉无明显抑菌活性，均可使其正常生长，而对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性不能完全消除。因此缓冲液量增加为500ml/筒。
试验表明，本品在规定检验量下用pH7.0无菌氯化钠―蛋白胨缓冲液以500ml/筒的量冲洗，对金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌的抑菌活性已完全消除。
4、样品的无菌检查
取样品15支依上述薄膜过滤法同法操作，按500ml/筒的缓冲液量冲洗，泵入细菌，真菌培养基后，按规定温度培养14天，逐日观察，样品组2管均澄清；阳性组2管泵入细菌培养基后分别接入金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌，培养2天，生长良好；阴性对照2管培养14天均澄清；判定供试品符合规定。
三、讨论
注射剂作为药品的一种重要剂型被广泛地应用于临床，由于其直接注入人体体内，发挥疗效，因此其安全性显得尤为重要。无菌检查是体现灭菌效果的主要手段，也是注射剂质量控制的一个重要指标。无菌检查的目的既要保证标准规定的阳性对照菌正常生长，又要准确无误地检查样品染菌情况，所以当建立药品的无菌检查法时，对其进行验证以证明所采用的方法适合于该药品的无菌检查；并确认供试品在该试验条件下无抑菌活性是十分必要的。无菌检查采用薄膜过滤法是取样量较大的集菌方法，具有代表性，不易漏检，该系统是全封闭过滤系统，避免了操作过程中外源性细菌的污染。
该法运用的注意事项：（1）做无菌试验前必须进行培养基的适用性检查，培养基的适用性检查包括培养基的无菌性检查和培养基的灵敏度检查，以确保初步环节可靠。（2）验证试验应在阳性试验室进行，而不能在供试品无菌检查的试验室中进行，以避免试验菌污染无菌检验的环境。
参考文献：
[1] 钱生稳，戴红娟，钱春江.注射用唑来膦酸无菌检查法方法学研究[J].海峡药学，2007， 19 （7）：46-48.
[2] 程浩.注射用头孢曲松钠无菌检查方法验证试验[J].科技致富向导，2015（01）.