逆向脂肪酸氧化循环(r-BOX)是目前合成中链脂肪酸最为有效的方式.中链脂肪酸因其所具有的消化吸收快,不易引起肥胖等特征收到广泛关注.然而目前缺少关于逆向脂肪酸氧化循环有效运行所需辅因子条件的研究.在本研究中,通过辅因子工程技术改造有益菌大肠杆菌K12,得到目前最为高效的中链脂肪酸合成效率.通过分析逆向脂肪酸氧化循环各个步骤的化学计量式以及后续的试验验证,我们发现胞内不足的NADH是制约逆向脂肪酸氧化循环的步骤的关键因素,并发现通过引入假丝酵母的甲酸脱氢酶,能够使得宿主菌以代谢副产物甲酸为底物生成足量的NADH,使得中链脂肪酸的产量由起始的1.2 g/L提高到3.1 g/L.更为重要的是,我们发现将乙酰辅酶A的供给与NADH的供给相偶联能够得到更高的代谢效率.因此,我们在新的NADH的供给之下再次重新优化乙酰辅酶A合成酶途径,在此条件之下我们发现乙酰辅酶A合成的活力以及胞内ATP水平是限制乙酰辅酶A合成酶途径的关键因子.在缓解了这两个瓶颈步骤后,中链脂肪酸的得率增加到4.7 g/L,是目前已知的最高产量.本研究提出的优化策略可以应用到其他乙酰辅酶A的衍生物以及其他多辅因子需求的合成产物.